動態濁度法測定丙泊酚中細菌內毒素含量

楊柳

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院·重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶 401121）

·檢驗檢測·

動態濁度法測定丙泊酚中細菌內毒素含量

楊柳

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院·重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶 401121）

目的建立丙泊酚中細菌內毒素定量測定的動態濁度法。方法通過測定供試液中外加內毒素的回收率進行干擾試驗，確定樣品無干擾濃度，定量測定樣品中的細菌內毒素含量。結果內毒素檢測濃度線性范圍為0.031 25～2.0 EU／mL（r＝－0.995 4）；樣品在稀釋成1.25 g／L及以下時對試驗無干擾作用，細菌內毒素回收率為50% ～200%；3批樣品的內毒素定量測定結果符合規定。結論丙泊酚中細菌內毒素的定量檢測用動態濁度法可行。

丙泊酚；細菌內毒素；動態濁度法；含量

丙泊酚為烷基酸類短效靜脈麻醉藥，麻醉作用起效快、蘇醒完全而且較快、術后惡心嘔吐發生率低、不良反應少[1－3]。經靜脈注射后，可使患者非常快速地進入睡眠狀態，因而使麻醉迅速而平穩，目前臨床普遍用于麻醉的誘導和維持[4]、重癥監護室中危重患者鎮靜，同時也應用于硬膜外或脊髓麻醉，常與鎮痛藥、肌松藥及吸入性麻醉藥同用。2015年版《中國藥典（二部）》收載的丙泊酚原料未對細菌內毒素作出規定，而細菌內毒素是控制藥物注射劑重要的安全性指標[5]，作為原料藥更應嚴格控制其細菌內毒素含量。因此，本研究中參照2015年版《中國藥典(四部)》通則1143中細菌內毒素檢查方法，探討用動態濁度法測定丙泊酚中細菌內毒素含量的可行性，并檢測了3批樣品的細菌內毒素含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BET－32M型細菌內毒素測定儀（天津市天大天發科技有限公司）；VG3 S25型漩渦混勻器（德國IKA公司生產）；移液器（德國艾本德＜EPPENDORF＞，規格為250 μL，1 000 μL）；無熱原空安瓿（湛江安度斯生物有限公司，批號為1603170，規格為5 mL）；無熱原吸頭（湛江安度斯生物有限公司，批號為1601040，1601260，規格為250 μL，1 000 μL）。

1.2 試藥

丙泊酚（原料，重慶博騰制藥科技股份有限公司，批號為130002，130003，13004）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150601－201580，規格為每支80 EU）；定量鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號為1411260，規格為每支1.25 mL，檢測范圍10～0.01 EU／mL，有效期至2017年10月）；細菌內毒素檢查用水（BET用水，湛江安度斯生物有限公司，批號為1207020，規格為每支5 mL）。

2 方法與結果[6－8]

2.1 確定供試品細菌內毒素限值（L）

按2015年版《中國藥典（四部）》細菌內毒素檢查中的公式 L＝K／M，式中 L表示供試品的細菌內毒素限值，K表示人每kg體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，M表示人用每kg體質量每小時的最大供試品劑量，計算出供試品的細菌內毒素限值。供試品作為注射液的原料，注射液的 K＝5 EU／（kg·h），通常丙泊酚注射液臨床的最大用量為成人 M＝15 mg／（kg·h）的給藥速率。計算得，L＝0.33 EU／mg。出于對藥品使用安全的考慮，作為原料時更應嚴格控制其質量，根據計算值適當調整，按計算限值的1／3計，將本品的細菌內毒素限值定為0.10 EU／mg。

2.2 建立細菌內毒素標準曲線

將1支定量鱟試劑加入1.25 mL BET用水復溶，并在11支反應試管中分別加入0.1 mL復溶的鱟試劑；將細菌內毒素工作標準品用BET用水進行稀釋，制成含細菌內毒素濃度為0.031 25，0.25，2.0 EU／mL的溶液（相鄰濃度間稀釋倍數為8），再將這3個濃度的的內毒素溶液分別加入到含有0.1 mL鱟試劑的反應試管中，每個濃度做平行的 3管，充分混勻，插入 BET－32M型細菌內毒素檢測儀內，同時做陰性對照2管 。當陰性對照的反應時間大于標準曲線最低點的反應時間時結束反應。將全部數據進行線性回歸分析，得到標準曲線回歸方程為 lg T＝－0.268 43 lg C＋2.903 7。其中，lg C橫坐標，為內毒素濃度的對數；lg T縱坐標，為平均反應時間的對數。結果 r＝－0.995 4(絕對值應不小于0.980)，平行管之間的 RSD均小于10%，陰性對照在規定檢測時間外，試驗有效，細菌內毒素標準曲線成立。見表1。

表1 細菌內毒素標準曲線及可靠性分析

2.3 確定供試品最大可稀釋倍數

稱取本品(批號為130002)100 mg，制成100 g／mL，L為0.10 EU／mg，標準曲線最低濃度(λ1)為0.031 25 EU／mL，供試品的 MVD＝CL／λ1＝320，故最小有效稀釋質量濃度為0.312 5 g／L。

2.4 供試品干擾試驗

取內毒素標準曲線的中點濃度(λm)0.25 EU／mL，作為供試品干擾試驗中添加的內毒素濃度。選擇樣品（批號為130002）做干擾試驗。供試品溶液（A液）制備：按最大可稀釋倍數，將供試品用BET用水分別稀釋成質量濃度為5，2.5，12.5，0.625，0.312 5 g／L的溶液；內毒素濃度 λm（0.25 EU／mL）的供試品溶液（B液）制備：將上述濃度的供試品溶液中分別加入0.25 EU／mL的內毒素工作標準品。取 20支反應試管，分別加入0.1 mL復溶的定量鱟試劑，再分別加入A液、B液，每個濃度做2個平行，將其混合均勻，插入BET－32M型細菌內毒素檢測儀內進行檢測。檢測結束后，按標準曲線回歸方程分別計算出各個被測溶液的內毒素含量，并按 R＝（Cs－Ct）／λm×100%計算回收率。其中，R為回收率，Cs為B液內毒素含量，Ct為A液內毒素含量。結果見表2。

表2 干擾試驗及樣品細菌內毒素含量測定結果（n＝2）

2.5 干擾驗證試驗

由表2可知，當供試品稀釋成 2.5 g／mL及以上時，其回收率為52%～103%，符合《中國藥典》的要求，則在該試驗條件下不存在干擾。但當質量濃度為2.5 g／L時，內毒素的回收率僅為52%，為使干擾作用降低到最小，更準確地測定內毒素的含量，因此建議采用1.25 g／L以上的稀釋濃度進行測定。

另取兩批（批號為130003，130004）樣品，按干擾試驗的方法分別制備質量濃度為1.25 g／L供試品溶液以及含相同供試品濃度并加有內毒素濃度為0.25 EU／mL的溶液，依法檢查。結果B液回收率均在50%～200%，符合藥典要求，且平均內毒素濃度乘以稀釋倍數后，小于規定的內毒素限值，供試品符合規定。

3 討論

家兔熱原檢查法和細菌內毒素檢查法作為熱原檢查的兩種基本方法收載于各國藥典中，以前多用家兔法，其缺點有重復性差，操作煩瑣，受家兔個體差異、環境的影響大且費時，被細菌內毒素檢查法代替已經是一種趨勢。細菌內毒素檢查法操作簡單，減少了動物的使用，靈敏度高，所受干擾少，耗時少。目前，細菌內毒素檢查法有凝膠法（凝膠限度試驗、凝膠半定量試驗）、光度測定法（濁度法和顯色基質法）。使用最多的方法為凝膠限度試驗，該試驗僅是對內毒素含量是否超過限度值作出判斷，無法定量。有文獻報道，如今國外對藥品的細菌內毒素檢查，采用定量方法測定的大于50%[9]。定量檢測也是發展的趨勢，能更直觀地評價藥品中細菌內毒素的含量，從而控制藥品的質量，監控生產過程中的質量。目前最常用的定量檢測方法的動態濁度法，靈敏度高，操作簡單，可通過觀察反應曲線來大致了解細菌內毒素的量，儀器能直接處理結果，減少人工計算的煩瑣，降低錯誤的發生，更準確測定內毒素含量[10－11]。

丙泊酚原料的質量標準收載于2015年版《中國藥典(二部)》中，但未對細菌內毒素作出限定。本試驗中研究了用動態濁度法對丙泊酚原料的細菌內毒素進行定量測定，在供試品中加入已知濃度的內毒素，通過對加入內毒素的回收率為判斷是否存在干擾，藥典中規定當回收率在50%～200%，認為此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。本試驗中，將供試品稀釋成質量濃度為1.25 g／L及以上時，回收率達到要求，此時對試驗無干擾作用，并對3批供試品進行檢查，結果均符合規定。因此，丙泊酚中細菌內毒素的含量的定量檢測可采用動態濁度法，可為相關標準提供參考，從而從源頭上控制產品的質量，提高了原料安全性，也保證了制劑的安全性，保證用藥安全。

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Content Determination of Bacterial Endotoxin in Propofol by Kinetic Turbidimetric Assay

Yang Liu
(Chongqing Institute for Food and Drug Control,Chongqing Engineering Research Center for Pharmaceutical Process and Quality Control, Chongqing,China 401121)

Objective To establish a kinetic turbidimetric assay(KTA)method for determine the concentration of bacterial endotoxin in propofol.M ethods Bacterial endotoxin was added into test sample for interference test,and the recovery rate was determined,no interference concentration was determined for the sample.The linear range and bacterial endotoxin in samples were determined.Results The linear range of bacterial endotoxin was 0.031 25－2.0 EU／mL(r＝－0.995 4).The sample had no interference to the test when it is diluted to 1.25 g／L and below.The recovery rate of bacterial endotoxin was 50% －200%.The concentration of endotoxin in the 3 batches of samples met the requirements for bacterial endotoxins.Conclusion The KTA method is suitable for the content determination of bacterial endotoxin in propofol.

propofol;bacterial endotoxin;kinetic turbidimetric assay;content

R927.11

A

1006－4931(2017)13－0028－03

2017－03－29)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.13.008

楊柳（1980－），女，碩士研究生，主管藥師，研究方向為藥品、藥包材質量標準，（電話）023－86072759（電子信箱）18775786＠qq.com。