中期阿爾茨海默病小鼠模型海馬組織Mst1r基因甲基化初探

唐曉琴　李昕　羅斯譯

[摘要] 目的 探討Mst1r基因在中期病程阿爾茨海默病模型（presenilins條件性雙基因敲除小鼠，dKO mice）中海馬組織的甲基化狀態。 方法 選取12月齡雌性dKO mice及同系野生型小鼠各3只，采用二代測序技術（簡化表觀亞硫氫酸鹽測序技術，RRBS）檢測其海馬組織基因組DNA以獲得甲基化異常基因。 結果 RRBS測序成果顯示中期AD dKO mice海馬組織中Mst1r基因呈超甲基化狀態（P<0.05）。 結論 超甲基化的Mst1r基因可能在中期AD dKO mice的病理過程中發揮著一定作用。

[關鍵詞] Mst1r基因；阿爾茨海默病；DNA甲基化；dKO mice

[中圖分類號] R749.16 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）15-13-03

[Abstract] Objective To explore the methylation status of Mst1r in the hippocampus of the Alzheimer disease （AD） model（presenilins conditional double knockout mice，dKO mice） in the medium term disease. Methods 3 cases of 12 month old female dKO mice and 3 cases of 12 month old syngeneic wild-type mice were selected.The two generation sequencing technology（simplified apparent sulfurous acid salts sequencing technology，RRBS）was used to detect the hippocampus to obtain genomic DNA methylation gene. Results RRBS sequencing showed that the Mst1r gene in the metaphase AD dKO mice hippocampus was hypermethylation（P<0.05）. Conclusion Hypermethylation of the Mst1r gene may play a role in the pathological process of metaphase AD dKO mice.

[Key words] Mst1r gene；Alzheimer disease；DNA Methylation；dKO mice

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD），作為老年癡呆癥的主要形式，是一種具有進行性發展病程的神經系統退行性病變，典型臨床癥狀為進行性記憶力下降、認知功能減退以及神經行為異常[1-3]。其主要病理變化包括由過度磷酸化的tau蛋白異常聚集形成的神經原纖維纏結、β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積為主形成的老年斑、神經元數目減少以及神經膠質細胞的改變等 [2-4]。但其具體的發病機制仍然尚不明確，因此對其進行早期研究、診斷、預防以及治療等都有著極其重大的經濟與社會意義。本實驗通過簡化表觀亞硫酸氫鹽測序技術（reduced representation bisulphite

sequencing，RRBS）初步建立起了12月齡中度神經系統退行性疾病AD模型 dKO mice海馬組織中基因組DNA甲基化譜，從而發現了超甲基化的基因Mst1r，這為后續進一步驗證以及深入探討AD的發病機制提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

親代dKO mice（基因型為Cre+/-，fPS1/fPS1，PS2-/-）由美國Ya-Ping Tang教授（Louisiana State University，USA）惠贈，其品系為B6CBAF1，是將小鼠前腦中的presenilin-1（PS1）基因通過Cre/loxP系統進行條件性敲除，所獲得的雜合子與將presenilin-2（PS2）基因通過基因打靶技術進行全身性敲除所獲得的雜合子雜交獲得[5]。子代dKO mice的喂養、傳代以及基因型判定方法如我們之前報道[6]所述。實驗組：12月齡dKO mice 3只，雌性，平均體重（35.0±2.6）g；對照組：12月齡野生型小鼠3只，雌性，平均體重（37.0±1.8）g。將6只實驗小鼠的海馬組織進行RRBS測序。

1.2 海馬組織的分離與DNA的提取

采用斷頸法處死實驗小鼠，剪開腦部皮毛并露出頭骨，剝離顱骨后露出小鼠全腦組織，分離全腦組織后將其轉移到置于冰袋上的無菌平皿中，快速分離出海馬組織并將其放入凍存管中，于液氮中冷凍30～60min后轉移至-80℃冰箱中儲存備用。海馬組織基因組DNA的提取采用天根生化科技有限公司的 TIANamp DNA提取試劑盒（貨號DP304），同時通過紫外分光光度計以及0.8%瓊脂糖凝膠電泳（100V，40min）分析DNA樣本的純度與濃度。

1.3 RRBS測序與數據分析

甲基化譜RRBS測序由杭州聯川生物技術有限公司進行（測序儀Illumina HiSeq 2500），測序文庫的構建如Brant JO等[7]所述。測序完成后，在NGSQCToolkit_v2.3軟件中過濾掉測序數據5%以上堿基質量數低于30的序列，再利用Bismark（vO.7.4）、edgeR等相關生物軟件對比分析過濾后的測序數據與小鼠參考基因組序列，篩選出異常甲基化基因，如我們報道[4]所述。篩選標注為P<0.05。

2 結果

2.1 海馬基因組DNA的質量

經紫外分光光度計測定，海馬組織基因組DNA樣品顯示：DNA濃度集中在100～140ng/μL，OD260/280≥1.8。見表1。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測（100V，40min）顯示：DNA樣本位于凝膠加樣孔附近，電泳條帶清晰完整，滿足RRBS測序要求，見圖1。

2.2 Mst1r基因甲基化篩選結果

運用軟件Bismark（vO.7.4）將測序數據比對到小鼠參考基因組序列上，篩選出Mst1r基因呈超甲基化狀態。Mst1r基因位于第九號染色體外顯子，起始位點為107917199，終止位點為107917365。根據測序結果，在edgeR軟件中進行基因差異表達分析，得到甲基化異常基因Mst1r（P<0.05）。見表2。

3 討論

流行病學調查顯示，2016年全世界有AD患者4700萬人，估計到2050年將達到1.31億人，2000 ～ 2013年死于中風、心臟病和前列腺癌的數量分別減少了23%、14%和11%，而死于AD的數量增長了71%[8]。由于人腦組織獲得困難，因此利用動物模型研究AD的表觀遺傳機制尤為重要。目前已經證明dKO mice這種動物模型與AD樣神經系統退行性疾病表現相似，如認知功能下降、學習記憶能力喪失、大腦皮質與海馬萎縮、嚴重神經元凋亡、側腦室與第三腦室擴大、神經膠質過多癥以及神經元內tau蛋白的過度磷酸化等[3，6]。該動物模型易于喂養和繁殖，2月齡即表現出輕微記憶損害，7～9月齡時皮質與海馬神經元丟失分別達24%和8%，皮質體積減少35%，側腦室開始擴大[3，9]；12月齡時皮質與海馬萎縮更加明顯，側腦室與第三腦室明顯擴大，表現出中期AD的表型 [3]。本課題組通過二代測序技術以及相關生物軟件對比分析12月齡dKO mice與對照組小鼠海馬組織基因組DNA甲基化分布狀況，發現了存在于第九號染色體外顯子的Mst1r基因呈超甲基化狀態。

Mst1r（macrophage stimulating 1 receptor）基因包含20個外顯子，其染色體定位于3p21.3，主要轉錄翻譯產物是由40 kD的α鏈與145 kD的β鏈組成的185 kD異二聚體。巨噬細胞刺激蛋白（MSP）是Mst1r及其同源基因STK、SEA的配體，是一種肝臟合成的具備免疫調節活性的糖蛋白 [10-11]。研究發現激活Mst1r基因可引發上皮細胞的分化、增殖、遷移及間質的侵襲，表明Mst1r基因可能與人類的一些上皮源性腫瘤相關。如在乳腺癌和肺癌中發現Mst1r基因呈高水平表達；在結直腸癌中發現Mst1r基因過度表達及剪切體變異[11-12]。Fleischer T等[13]發現在乳腺癌中Mst1r基因啟動子區域甲基化水平與基因表達呈負相關；姚雨江等[14]研究發現Mst1r基因的單核苷酸多態性（SNPs）與結直腸癌淋巴結轉移有關；Angeloni D等[15]通過研究Mst1r基因近端啟動子的甲基化狀態，發現在乳腺癌、宮頸癌、非小細胞肺癌中Mst1r基因呈去甲基化狀態；Dai W等[16]研究發現Mst1r基因是鼻咽癌的易感基因，在鼻咽癌中存在Mst1r基因突變和超甲基化。目前國內外尚未有該基因在AD表觀遺傳機制中的研究報道，本實驗通過RRBS測序發現異常甲基化基因Mst1r呈超甲基化狀態，初步提示超甲基化的Mst1r基因可能在中期AD dKO mice的病理過程中發揮著一定作用。

在后續的研究中，我們將進一步增加樣本量，并運用單基因甲基化測序（BSP）、甲基化特異性PCR、RT-PCR、免疫印跡 （Western blotting）及免疫組織化學技術等方法進行驗證，同時對比分析其在早期和晚期dKO mice海馬組織中甲基化狀態，為全面了解Mst1r基因在不同AD病程中的甲基化改變情況提供資料。

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（收稿日期：2017-06-04）