巴戟天多糖含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中Cbfa—1mRNA表達(dá)的影響

賴滿香　馮娟　阮志燕

[摘要] 目的 探討巴戟天多糖含藥血清對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）骨向分化過程中核心結(jié)合因子ɑ-1（Cbfɑ-1）mRNA表達(dá)的影響。 方法 全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，采用pNPP法檢測不同濃度r巴戟天多糖含藥血清（高、中、低）對BMSCs堿性磷酸酶（ALP）活性的影響，并以其最佳作用濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)分成空白組、成骨誘導(dǎo)組、巴戟天多糖含藥血清組、聯(lián)合組（巴戟天多糖含藥血清組+成骨誘導(dǎo)組），各組用藥14d，采用RT-PCR技術(shù)檢測各組BMSCs Cbfa-1 mRNA表達(dá)的情況。 結(jié)果 與對照組比較，不同劑量的巴戟天多糖含藥血清均可提高BMSCs分泌ALP（F=126.278，P<0.05），其中高劑量組的作用強(qiáng)度高于其它劑量組；與空白組相比，成骨誘導(dǎo)組、巴戟天多糖含藥血清組、聯(lián)合組均能上調(diào)BMSCs中Cbfa-1 mRNA的表達(dá)（F=261.412，P<0.05）；但與成骨誘導(dǎo)組相比，巴戟天多糖含藥血清組不及成骨誘導(dǎo)組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.721，P<0.05）。 結(jié)論 巴戟天多糖含藥血清能夠促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并能上調(diào)Cbfa-1 mRNA的表達(dá)，但其作用不及成骨誘導(dǎo)強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞] 巴戟天多糖含藥血清；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；堿性磷酸酶；骨向分化；Cbfa-1

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）15-27-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of morindae officinalis polysaccharide （MOP） containing serum on Cbfa-1 mRNA expression during the differentiation from BMSCs to the osteoblast. Methods BMSCs were isolated by whole bone marrow adherent method.Different concentrations of MOP-containing serum，including high dosage，middle dosage and low dosage，were added to BMSCs section to detect the alkaline phosphatase （ALP） activity by pNPP method，the best dosage was added to the next experiment.BMSCs were divided into the blank group，the osteogenic induced group，the MOP-containing serum group，MOP-containing serum and the osteogenic induced co-culture group.Cbfa-1 mRNA in each group were detected by RT-PCR at day 14. Results Compared with the control group，different concentrations of MOP-containing serum could elevate serum ALP activities（F=126.278，P<0.05），and the high dosage was the best.Compared with the blank group，Cbfa-1 mRNA expression levels increased in the osteogenic induced group，MOP-containing serum group and co-culture group， difference has statistical significance（F=261.412， P<0.05）.Cbfa-1 mRNA expression levels was lower than the osteogenic induced group， difference had statistical significance（t=26.721，P<0.05）. Conclusion The MOP-containing serum can promote the differentiation of BMSCs to osteoblasts，and increase Cbfa-1 mRNA expression，but its strength is lower than the osteogenic induced.

[Key words] MOP-containing serum；Bone marrow mesenchymal stem cell；Alkaline phosphatase；Osteogenic differentiation；Cbfa-1

巴戟天為茜草科多年生藤植物，為我國著名的四大南之一，現(xiàn)代藥理研究證明：巴戟天具有強(qiáng)壯骨骼、調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)甲狀腺功能、抗衰老、抗

疲勞、增強(qiáng)記憶、抗腫瘤及促進(jìn)造血等作用[1]。巴戟天多糖（morindae officinalis polysaccharide，MOP）為巴戟天的有效成分之一，有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，巴戟天多糖具有預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用[2-3]，體外能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，提高成骨細(xì)胞分泌ALP與骨鈣素，抑制破骨細(xì)胞活性[4]，巴戟天提取物能促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化，并能加強(qiáng)Cbfa1的表達(dá)[5]，但巴戟天作用于MSCs的具體成分不清。本實(shí)驗(yàn)觀察巴戟天多糖含藥血清對SD大鼠BMSCs向成骨分化過程中核心結(jié)合因子ɑ-1（Cbfɑ-1）表達(dá)的影響，從干細(xì)胞水平探討巴戟天多糖促BMSCs骨向分化中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)所用動物為清潔級3月齡SD大鼠40只，體重245～255g；清潔級3月齡SD雌性大鼠1只，體重250g，用于BMSCs的提取。所用大鼠均由暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（許可證號：SYXK（粵）第2012-0117）。

1.2 儀器、藥物與試劑

3111系列CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo Forma公司，SWCJ-1超凈工作臺購于蘇州凈化設(shè)備有限公司，BPH-300倒置相差顯微鏡購于日本Nikon公司。9600 PCR擴(kuò)增儀購于美國PE公司。

巴戟天多糖購于陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司；ALP測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所，Trizol Reagent購于北京賽百盛公司，RT試劑盒購于日本東洋坊。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 巴戟天多糖含藥血清制備 按照隨機(jī)數(shù)字法將40只大鼠分成4組，每組10只。高劑量組每天給予巴戟天多糖2.5g/kg；中劑量組每天給予巴戟天多糖1g/kg；低劑量組每天給予巴戟天多糖0.5g/kg；對照組不給予藥物，每天灌胃生理鹽水100mL/kg；每組連續(xù)給藥7d。

1.3.2 BMSCs細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 采用全骨髓貼壁法，取3月齡SD大鼠拉頸處死，于75%乙醇消毒，取出大鼠股骨，切除股骨兩端骨骺，用PBS液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集混合液，1500r/min，離心5min，吸走上清液，用含10% FBS的低糖DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并以5×106/mL的密度將細(xì)胞接種到25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積為5%飽和濕度的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下，觀察BMSCs在生長過程中的形態(tài)變化。取生長良好的第3代細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29，CD44，CD45，CD34的表達(dá)，以確定是否符合BMSCs的生物特征。

1.3.3 pNPP法檢測巴戟天多糖含藥血清對BMSCs ALP的影響 取生長良好的第三代BMSCs，分別加入巴戟天多糖含藥血清高、中、低劑量組培養(yǎng)液和對照組培養(yǎng)液，連續(xù)干預(yù)14d。收集各組細(xì)胞上清液，采用pNPP法進(jìn)行ALP含量的測定。并從中選取巴戟天多糖含藥血清促BMSCs分泌ALP的最佳劑量應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 RT-PCR檢測各組BMSCs Cbfa-1 mRNA的表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs，分別添加空白組（含15%胎牛血清低糖DMEM完全培養(yǎng)液），成骨誘導(dǎo)組（低糖DMEM 培養(yǎng)液+15%胎牛血清+10-8 mol/L地塞米松+50 mg/L維生素C+10-2mol/Lβ磷酸甘油），巴戟天多糖含藥血清組（低糖DMEM培養(yǎng)液+MOP含藥血清促BMSCs分泌ALP的最佳劑量）和聯(lián)合組培養(yǎng)液（MOP含藥血清組+成骨誘導(dǎo)組），培養(yǎng)14d后采用RT-PCR檢測Cbfa-1 mRNA的表達(dá)。以β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用Stata11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較運(yùn)用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

剛接種的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，呈圓形，后48h后逐漸出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，形態(tài)由圓盤狀逐漸向外伸出突起而轉(zhuǎn)變短梭形（圖1）。72h附壁鋪伸細(xì)胞數(shù)量增多，呈多細(xì)胞集落性分布，彼此不相接觸。第4、5天開始形成典型的呈均勻分布的MSCs簇狀增生灶，且隨培養(yǎng)時間的延長，成纖維細(xì)胞樣集落形成量逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了根本的變化，呈長梭形，緊密排列。第6天后MSCs迅速增殖擴(kuò)增，不僅成纖維細(xì)胞樣集落形成數(shù)量迅速增加，而且還不斷擴(kuò)大，相互間融合。隨著細(xì)胞數(shù)量增加體積增大，細(xì)胞形態(tài)趨于一致。10～14d，非附壁細(xì)胞經(jīng)反復(fù)換液而消失，細(xì)胞90%以上融合，融合細(xì)胞都呈梭形，緊密排列類似漩渦狀（圖2）。第3代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：CD44、CD29陽性細(xì)胞比率分別為97.56%和95.24%，CD45、CD34陽性細(xì)胞比率分別為0.57%和0.48%。符合BMSCs的生物學(xué)特性。

2.2 巴戟天多糖含藥血清對BMSCs ALP的影響

與對照組相比，巴戟天多糖含藥血清高、中、低劑量組的ALP 活性均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=126.278，P<0.05），各劑量組作用的強(qiáng)弱：巴戟天多糖含藥血清高劑量>巴戟天多糖含藥血清中劑量組>巴戟天多糖含藥血清低劑量組，結(jié)果表明，巴戟天多糖含藥血清具有促進(jìn)BMSCs分泌ALP，其中高劑量組促BMSCs分泌ALP的能力最佳。見表1。

2.3 各組Cbfa-1 mRNA的表達(dá)水平

經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示：成骨誘導(dǎo)組、巴戟天多糖含藥血清組和聯(lián)合組的輝度比值高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=261.412，P<0.05）；成骨誘導(dǎo)組與巴戟天多糖含藥血清組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.721，P<0.05）。

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）起源于骨髓的中胚層，是一種具有多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，在體外不同的誘導(dǎo)條件下，能分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞[1]。因其具有取材方便，體外增殖能力強(qiáng)，長期傳代不改變生物學(xué)特征等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于骨組織工程中。本實(shí)驗(yàn)采用最常用的全骨髓貼壁法[6]進(jìn)行BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見細(xì)胞接種后48h內(nèi)即可貼壁，72h后大部分細(xì)胞貼壁生長；細(xì)胞首次接種培養(yǎng)10d后即可達(dá)到80%以上融合，經(jīng)過幾次傳代后，生長的細(xì)胞呈形態(tài)均一、排列有序的成纖維樣細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測中可見近90%以上的細(xì)胞處于G0/G1期，說明經(jīng)擴(kuò)增至P3代的BMSCs 仍有一部分細(xì)胞處于相對靜止未分化的狀態(tài)，從而可保證用于后續(xù)基因傳遞的細(xì)胞仍保持干細(xì)胞特性，符合BMSCs的生物學(xué)特性[7]。

BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中的重要表現(xiàn)是細(xì)胞能夠合成、分泌表達(dá)成骨特異性的蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)分。有研究證明，ALP是早期BMSCs向成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵性標(biāo)志之一[8-9]。ALP是一種鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能促進(jìn)細(xì)胞成熟和鈣化[10]，ALP活性越高說明成骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞分化越明顯。因此ALP在BMSCs骨向分化中扮演重要角色，測定ALP活性變化可以衡量BMSCs骨向分化的成熟程度[11]。本實(shí)驗(yàn)選用ALP活性來評價不同劑量的MOP含血清對BMSCs分泌ALP的影響，并以此篩選最佳的促骨向分化濃度，以應(yīng)用到后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，不同劑量的MOP含藥血清組可增加BMSCs上清液中的ALP的表達(dá)與分泌，這說明在此濃度范圍內(nèi)的MOP含藥血清能夠促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化，其中高劑量MOP含藥血清效果最佳。

核心結(jié)合因子a（core binding factor alpha 1，Cbfa1）是runt結(jié)構(gòu)域家族成員，其表達(dá)僅在骨組織和成骨細(xì)胞中檢測到[12]。有研究表明Cbfa1是MSCs向成骨細(xì)胞分化過程中的一種骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，為骨形成的關(guān)鍵基因，是成骨細(xì)胞分化和功能的中心調(diào)控因子，決定著成骨細(xì)胞的發(fā)生與分化[13]。在敲除Cbfa1基因的小鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，缺少此基因可阻礙小鼠成骨細(xì)胞分化，抑制小鼠骨骼的軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨，而Cbfa1（+/-）雜合子小鼠表現(xiàn)育不全及顱骨鈣化延遲[14]。Ducy等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的胚胎發(fā)育期，可見Cbfal mRNA在顱骨、中軸骨及四肢骨MSCs聚集區(qū)表達(dá)，而這些細(xì)胞是均能分化成成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞的雙能前體細(xì)胞，此后，隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，當(dāng)MSCs進(jìn)一步分化時，Cbfal只表達(dá)于向成骨細(xì)胞定向分化的細(xì)胞中，而在已分化了的軟骨細(xì)胞中已檢測不到它。由此可見，在BMSCs向成骨細(xì)胞分化中需要Cbfal的參與。本實(shí)驗(yàn)檢測MOP含藥血清在誘導(dǎo)BMSCs骨向分化過程中Cbfa-1基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)組、巴戟天多糖含藥血清組和聯(lián)合組的Cbfa-1 mRNA表達(dá)均有升高空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MOP含藥血清在促BMSCs骨向分化過程中，可以上調(diào)Cbfa-1 mRNA的表達(dá)。而與成骨誘導(dǎo)組比較，巴戟天多糖含藥血清組不及成骨誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MOP含藥血清的作用強(qiáng)度不及化學(xué)誘導(dǎo)劑。

綜上所述，本研究證明巴戟天多糖含藥血清可以促進(jìn)BMSCs向成骨分化，這一過程中，上調(diào)Cbfa1mRNA的表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。

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（收稿日期：2017-05-11）