應用MALDI-TOF-MS檢測肺鱗癌患者血清多肽并分析其與化療療效相關性

趙冠華 許斌 李曉燕 湯傳昊 秦海峰 王紅 楊紹興 王偉霞 高紅軍 何昆 劉曉晴

肺癌（lung cancer）目前是臨床上最常見的惡性腫瘤。其中80%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），最常見的病理類型包括：肺鱗癌（squamous cell carcinoma of lung, SCC）與肺腺癌（adenocarcinoma of lung）[1,2]。盡管抗血管生成治療、免疫治療、靶向治療等已被食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準為晚期SCC患者的二線或多線治療手段。晚期SCC的臨床治療仍停留在以傳統化療為主的階段，鉑二聯方案化療依然是晚期SCC患者主要的一線治療手段[3]。但是對于不同SCC患者，其化療療效卻不相同。近年來雖然進行了多項針對單基因標志物如ERCC1、RRM1、TUBB3及XRCC1的研究，并初步顯示出一定意義，但在進一步擴大樣本驗證的隨機對照III期臨床研究中均未能有效預測療效[4,5]。所以迄今為止無一標志物可用于指導臨床化療藥物的選擇。因此臨床上亟需一種可以更有效預測SCC化療療效的方法。質譜檢測蛋白質組學研究已廣泛應用于腫瘤學的各個領域[6-14]，既往研究發現化療藥物耐藥性及藥物代謝酶多態性可導致不同的患者對于化療藥物的獲益不同。因此本研究應用MALDI-TOF-MS技術從蛋白質及多肽等更微觀的角度了解初治晚期SCC患者化療前血清多肽與化療療效的關系，期望為實現晚期SCC患者的個體化化療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本 本研究共入組81例2014年10月-2016年4月期間就診于解放軍第307醫院肺部腫瘤內科的初治晚期SCC患者，在患者未進行任何治療時采集血清樣本，告知并簽署知情同意書。納入患者滿足以下標準：①經組織病理學或細胞學確診為SCC的患者（IIIb期、IV期）；②年齡≥18周歲；③美國東部腫瘤協作組體力評分（Eastern Cooperative Oncology Group Performance Status, ECOG PS）＜2分；④入組患者均排除心、肝、腎等重要臟器疾病；⑤此前未接受過化療、放療、靶向治療等腫瘤專科治療；⑥一線治療行紫杉醇類聯合鉑類方案化療，紫杉醇（135 mg/m2-175 mg/m2）+順鉑（75 mg/m2）或卡鉑［峰下面積（area under curve, AUC）=5-6）］，多西他賽（60 mg/m2-75 mg/m2）+順鉑（75 mg/m2）或卡鉑（AUC =5-6），第1天用藥（順鉑第1、2天給藥），每3周重復。

1.2 試劑和儀器 三氟乙酸（Trifluoracetic acid，TFA，美國Sigma公司）；乙腈（Acetonitrifle，CAN，美國Fisher公司）；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA）和混合標肽（Bruker公司）；銅離子螯合納米磁珠（MB-IMAC-Cu2+）；緩沖液體系（國家生物醫學分析中心）；MALDI-TOF質譜儀（Ultraflex）（德國Bruker公司）；磁珠分離器（Magnetic bead separator; MBS）（德國Bruker公司）；SIGMA臺式冷凍離心機3K15（美國SIGMA公司）；MTP-Anchorpchip靶（Var/384）（德國Bruker公司）；分析軟件ClinProTools 3.0版（CPT, 德國Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 患者分組 納入的初治晚期SCC患者，一線行紫杉醇類聯合鉑類方案化療，并每兩周期進行療效評價，記錄患者近期療效、無進展生存期（progression free survival,PFS），從接受化療開始，到評價疾病進展或者發生因為任何原因的死亡為止）。按照實體瘤療效評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）1.1評價治療療效。化療療效評價為完全緩解（complete response, CR），部分緩解（partial response, PR），疾病穩定（stable disease, SD），疾病進展（progressive disease,PD）。本研究僅選取CR、PR、PD的患者入組。將評效為CR或PR的SCC患者定義為化療敏感組，評效為PD的SCC患者定義為化療耐藥組。將入組標本按照3：1的比例隨機分為訓練組（敏感組I與耐藥組I）和驗證組（敏感組II與耐藥組II）。

1.3.2 血清樣本采集 化療前晨起空腹取外周血3 mL，尿液10 mL。4oC冰箱靜置30 min后，4oC低溫離心：4,000 rpm、10 min，取上層血清分裝于凍存管，于-80oC冰箱保存。

1.3.3 血清預處理 從4oC冰箱中取出SPE-CM磁珠懸浮液一管，反復倒置，使磁珠完全、均勻的懸浮與液相中。在200 μL樣品管中加入7 μL SPE-CM磁珠混懸液，10 μL血清、95 μL SPE-CB反復吸打數次，使磁珠與SPE-CB、血清混合均勻，室溫靜置5min。將樣品管置于磁珠分離器上，磁珠貼壁1 min，使磁珠與液體分離，待液體澄清后，吸凈液體。將樣品管從磁珠分離器上移走，并加入100 μL SPE-CW，反復吸打數次，使磁珠與SPE-CW混合均勻，室溫靜置2 min。將樣品管轉移到磁珠分離器上，磁珠貼壁1 min，使磁珠與液體分離，待液體澄清后，吸凈液體，重復上步2次。將樣品管中加入10 μL SPE-CE，反復吸打10次以上，使磁珠與SPE-CE混合均勻，室溫靜置5 min。將樣品管轉移到磁珠分離器上，磁珠貼壁1 min，使磁珠與液體分離，待液體清澈后，將液體移入干凈的樣品管中。凍存于-20oC冰箱，待進行質譜分析。

1.3.4 點靶 將飽和的HCCA于0.1% TFA和50% ACN的混合液混勻于Eppendorf管內，配成基質溶液，將基質溶液與標準品按照2:1的比例均勻混合，吸取1 μL點樣，外部校正儀器。再將磁珠處理后的待檢樣本1 μL與預配基質溶液1 μL按照1:1比例均勻混合，吸取1 μL點于MTP-Anchorpchip靶上，室溫靜置等待自然干燥。

1.3.5 質譜檢測 將點靶完成的MTP-Anchorpchip靶放入MALDI-TOF-MS進行分析。為降低操作誤差和系統誤差，每組樣本檢測前均用1個標準品（標準的多肽混合物）點靶，作外標進行檢測，外部校正儀器。MALDITOF-MS最佳掃描的質荷比（mass-to-charge ratio, m/z）區間為800 Da-10,000 Da，質譜信號每次掃描累加500次，每份樣本共累加3,000次，保存累加圖譜，從而得到精準的血清多肽指紋圖譜，圖譜由各個不同m/z的多肽峰組成。

1.4 統計學分析 MALDI-TOF-MS分析數據經CPT軟件進行質譜圖譜處理，分別得到SCC患者的血清指紋多肽質譜。比較敏感組I與耐藥組I的多肽指紋圖譜，用軟件內置的3種算法：快速分類法（quickclassifier, QC算法）、遺傳算法（genetic algorithm, GA算法）和監督神經網絡算法（supervised neural network, SNN算法），分別建立療效預測模型。選出其中最優算法所建立的療效預測模型，并自動生成了建模所用多肽并計算了多肽AUC。隨后應用驗證組樣本對所建模型進行盲樣驗證。運用SPSS軟件（版本windows 19.0）對入組訓練組和驗證組的臨床特征：年齡、性別、吸煙進行配對四個表卡方檢驗，用以分析兩組人群臨床特征的差異。將敏感組I及耐藥組I的差異多肽結合臨床預后參數PFS運用雙變量相關分析，得到各個差異多肽與PFS間的相關系數，即pearson相關系數。檢測血清差異多肽與SCC患者PFS的相關性。

2 結果

2.1 入組患者一般臨床特征 共入組81例患者，訓練組及驗證組在年齡、性別、吸煙情況及臨床分期等方面無統計學差異，入組患者具體信息見表1。

2.2 療效分析 81例接受紫杉醇類聯合鉑類化療的初治晚期SCC患者隨訪至2016年12月，全部患者均進展。其中一線評效，CR 0例，PR 40例（40/81, 49.4%），PD 41例（41/81, 50.6%）。訓練組共納入30例敏感患者（敏感組I），31例耐藥患者（耐藥組I）；驗證組共納入敏感（敏感組II）與耐藥（耐藥組II）患者各10例。敏感組I中位PFS為7.2個月（95%CI: 4.4-14.5）；耐藥組I中位PFS為1.8個月（95%CI: 0.7-3.5）。

2.3 訓練組的血清多肽指紋圖譜 對訓練組血清樣本進行預處理，MALDI-TOF-MS質譜檢測，得到敏感組I及耐藥組I的血清多肽指紋圖譜，結果見圖1、圖2。

2.4 訓練組的血清差異多肽結果分析

2.4.1 化療療效相關多肽的發現 運用CPT軟件對敏感組I及耐藥組I的血清指紋圖譜進行處理，在800 Da-10,000 Da范圍內，檢測到96個差異多肽，統計學處理后具有統計學意義（P＜0.001）的差異多肽有16個，具體信息見表2。

2.4.2 化療療效預測模型的建立 運用CPT軟件將最具統計學差異的兩個峰（3,159 Da, 4,270 Da）分別作為橫縱坐標繪制了2D多肽峰聚類分析圖（圖3）。用軟件內置的3種算法（SNN、GA、QC算法）分別建立診斷模型，選出其中最優算法（GA算法）所建立的診斷模型。運用GA算法建立的化療療效預測模型，由5個多肽組成，分別為1,897.75 Da、2,023.93 Da、3,683.36 Da、4,269.56 Da、5,341.29 Da（圖4）。該模型對化療敏感組患者的識別率為95.11%，交叉驗證率為89.18%。

表 1 患者基本情況Tab 1 Basic information of patients

表 2 訓練組差異多肽質荷比及表達變化Tab 2 m/z and expression change of training group

2.5 盲法驗證 驗證組通過同樣方法進行質譜檢測，并對所建立的療效預測模型進行盲樣驗證。9例化療敏感型患者（9/10）和8例耐藥型患者（8/10）被準確診斷。10例敏感型患者中有1例假陰性，10例耐藥型患者中有2例假陽性。該模型的準確率為85.0%，靈敏度為90.0%，特異性為80.0%。驗證結果見表3。

表 3 驗證組結果Tab 3 Result of validation group

圖 1 訓練組的血清多肽指紋圖譜（A：敏感組I；B：耐藥組I）Fig 1 Serum peptide profiles of training group (A: sensitive groupI; B: resistant group I)

圖 2 血清多肽圖的聚類分析（紅色：敏感組I；綠色：耐藥組I）Fig 2 Clustering analysis of MS-based serum peptide profiles(red: sensitive group I; green:resistant group I)

圖 3 建模的5個多肽峰（紅色：敏感組；綠色：耐藥組）Fig 3 Specific peptide peaks of model (red: sensitive group I;green: resistant group I)

3 討論

SCC是肺癌中常見的病理類型，約占肺癌新發病例的1/4[15,16]。近幾年來，靶向治療、免疫治療及抗血管生成治療等各種治療方式進展迅速，許多新藥已進入臨床實踐階段[17-20]。但晚期SCC一線治療仍然主要以化療為主，其標準鉑二聯方案化療只能給患者帶來有限的獲益[3]。其總緩解率約為25%-35%，中位PFS 4個月-6個月，OS為8個月-10個月[21]。并且不同的患者對于化療藥物的獲益不同。所以實現化療藥物最優選擇達到個體化預見性治療尤為重要。近年來雖然進行了多項針對單基因標志物如ERCC1、RRM1、TUBB3及XRCC1的研究，并初步顯示出一定意義，但在進一步擴大樣本驗證的隨機對照III期臨床研究中均未能有效預測療效[4,5]。Bepler等[4]在晚期NSCLC患者中進行了ERCC1和RRM1基因表達與吉西他濱聯合卡鉑化療療效相關性的多中心III期臨床試驗（NCT00499109），研究顯示：實驗組與對照組的PFS（6.1個月 vs 6.9個月）及 OS（11.0個月 vs 11.3個月）均無統計學差異。由此可知單基因標志物對化療療效預測的意義非常有限。進一步的基礎研究也表明細胞毒藥物應答與單基因標志物的相關性較弱[22,23]。已有研究表明藥物代謝酶多態性可導致不同患者對于化療藥物的獲益不同。因此通過蛋白質組學研究尋找到差異多肽可能會有效地預測化療療效。

近年來，蛋白質組學已廣泛應用于腫瘤診斷、治療等各方面的研究。其主要質譜檢測技術包括表面加強激光解析電離飛行時間質譜（surface-enhanced laserdesorption ionization-time of flight-mass spectrometry, SELDI-TOFMS）、MALDI-TOF-MS等[24]。MOLID-TOF-MS技術為最具代表的蛋白質檢測技術。MALDI技術是一種軟電離技術，使生物大分子離子化，其具有靈敏度高、準確度高、穩定性好等特點[25,26]，并被廣泛應用于多種腫瘤的組織、血清及尿液蛋白質組學的研究中[27,28]。Han等[29]運用SELDI-TOF-MS檢測60例接受VP（依托泊苷+順鉑）方案化療的廣泛期小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）患者治療前血清多肽。發現SCLC患者VP方案化療耐藥相關多肽并運用3個在耐藥型患者血清樣本中表達明顯增高的差異多肽建立了耐藥模型。但遺憾的是，后面研究者進行重復驗證時并未得到一致結果。究其原因可能與SELDI-TOF-MS技術的耐污染物能力、穩定性、結果可靠性及重復性均較差有關[30]。我們的研究采用了穩定性較好的MALDI-TOF-MS檢測初治晚期SCC患者接受紫杉醇類聯合鉑類化療前血清多肽，并分析其與化療療效的相關性。檢測化療前血清樣本發現化療敏感型與耐藥型患者間存在血清多肽差異。在800 Da-10,000 Da范圍內，檢測到96個差異多肽，統計學處理后具有統計學意義（P＜0.001）的差異多肽有16個。運用1,897.75 Da、2,023.93 Da、3,683.36 Da、4,269.56 Da、5,341.29 Da共5個多肽建立療效預測模型。該模型對化療敏感組患者的識別率為95.11%，交叉驗證率為89.18%。經驗證組驗證其模型具有較高的靈敏度（90%）和特異性（80%），且表現出較好的穩定性及可重復性。

楊邵瑜等[31]應用MALDI-TOF-MS檢測25例初治晚期NSCLC患者接受吉西他濱聯合鉑類方案化療前血清多肽與化療療效的相關性。篩選出5個差異多肽在耐藥組患者中表達明顯增高，考慮可能與吉西他濱及順鉑耐藥相關。但其僅檢測到敏感組與耐藥組患者血清多肽中存在差異，并未建立診斷模型進行化療療效的預測，也未分析差異多肽與臨床預后參數之間的相關性。與其相比，本研究樣本量較大，且全部樣本均來自臨床治療以化療為主的晚期SCC患者。不僅檢測到了血清差異多肽，初步建立了療效預測模型。而且更進一步對血清多肽與化療療效的相關性進行了分析。將具有統計學意義的差異多肽按照P值由低到高排列。結合臨床預后參數PFS運用雙變量相關分析，得到各個差異多肽與PFS間的相關系數。結果發現：m/z為4,232.04 Da、4,269.56 Da的差異多肽與SCC患者PFS存在相關性（P＜0.001）。該結果顯示這2個多肽與SCC患者接受紫杉醇類聯合鉑類方案化療的療效密切相關，其相關性具有統計學意義。其中4,269.56 Da的差異多肽峰同樣用于建立療效預測模型，進一步說明了其多肽與化療療效的密切關系。既往松本和子等[32]也通過檢測接受曲妥珠單抗治療的乳腺癌患者血漿中的糖酵解產物，找到R-L巖藻糖酶的表達與患者的PFS顯著相關。并運用m/z為2,534 Da的差異多肽對患者進行PD與非PD的分組，其靈敏度為75% ，特異性為82%。研究顯示乳腺癌患者血漿中存在與曲妥珠單抗敏感性明確相關的糖酵解生物標記物，可對接受曲妥珠單抗治療的乳腺癌患者進行療效預測。但與我們的研究相比，松本和子并未建立療效預測的分類模型，而是通過單個差異多肽進行PD組與非PD組的區分，因此其靈敏度和特異性均較低。

本研究通過運用MALDI-TOF-MS技術對接受紫杉醇類聯合鉑類方案化療的晚期SCC患者的血清樣本進行了質譜檢測，發現化療敏感型與耐藥型SCC患者間存在血清多肽差異。應用CPT軟件建立了能夠區分敏感型及耐藥型SCC患者的分類模，型并進行了初步驗證，得到了較穩定的結果。但本研究為單中心研究，樣本量有限，下一步將擴大樣本量完善所建立的分類模型，并對檢測到的差異多肽進行進一步鑒定，以期找到能夠預測化療效果的血清標志物，最終實現肺癌的個體化化療。