TNF-α多肽抑制劑的合成及初步活性篩選

曹穎男

廣州市中山大學新華學院，廣東廣州 510520

TNF-α多肽抑制劑的合成及初步活性篩選

曹穎男

廣州市中山大學新華學院，廣東廣州 510520

目的 初步探究TNF-R1的胞外區第四功能域CRD4衍生多肽對TNF-α與受體TNF-R1結合過程的影響。方法 以CRD4的部分序列為模板設計衍生小肽片段，采用生物活性酶聯免疫吸附測定法 (BioLISA)觀察所合成的小肽對于TNF-α與其受體TNF-R1結合情況的影響。結果 小肽Pep 3在濃度分別為20，40，60，80，100，120 μM可劑量依賴性抑制TNF-α與其受體TNF-R1的結合；然而肽段Pep 1和Pep 2均未表現明顯的抑制效果。結論 TNF-R1的CRD4的A1模塊衍生小肽Pep 3能夠有效抑制TNF-α與其受體TNF-R1結合，提示該序列所在區域是影響TNF-α與其受體TNF-R1結合的關鍵部位。

TNF-α；TNF-R1；CRD4；短肽；BioLISA

腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一種主要由單核細胞/巨噬細胞產生的、具有廣泛生物學活性的細胞因子。在類風濕關節炎，腸炎和感染性休克等疾病的發生、發展中占有很重要的地位[1-2]。TNF-α主要通過與其位于細胞膜上的I型受體(TNF-R1)的細胞外區域結合之后，來啟動其信號通路。TNF-R1的細胞外區域包含四個亞功能域，分別是CRD1(residues15-53)，CRD2(residues 54-97)，CRD3(residues 98-138)和 CRD4(residues 139-166)。其中CRD1，CRD2和CRD3分別由一個A型模塊和一個B型模塊構成，CRD4不同于其他3個亞功能域，它是由一個A模塊(residues 139-150)和一個結構不規則的C模塊(residues 153-172)構成[3-4]。顯然對于各個亞功能域來說，A模塊是相對保守的結構，極有可能在TNF-α和TNF-R1的結合過程中發揮重要作用，但目前國內外對于CRD4的A模塊在TNF-R1與TNF-α相互識別的過程中所起到的作用鮮有報道。本研究針對于TNF-R1的CRD4區域A模塊設計衍生小肽，檢測其對于TNF-α和TNF-R1的結合的影響。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

2-Chlorotrityl chloride樹脂和Fmoc保護氨基酸等購自吉爾生化（上海）公司。人TNF-α和人TNF-α BioLISAkit試劑盒購自奧地利Bender Medsystems公司。短肽S11K和WP9QY由中山大學藥學院卜憲章教授友情饋贈。

1.2 實驗儀器

固相多肽合成反應器，電子分析天平，酶標儀。

2 實驗方法

2.1 多肽的合成及質譜表征

采用Fmoc/tBu法[5]逐步合成小肽。所得肽分子量經ESI-MS質譜分析。

2.2 TNF-αbinding測試

TNF-α以PBS緩沖液稀釋至濃度為20 ng/mL，與等體積的肽溶液混合，配成200 μL反應體系，25℃孵育1 h。以等量的PBS緩沖液及DMSO與TNF-α孵育，分別作為空白對照和溶劑對照。S11K肽和WP9QY肽分別為陰性對照和陽性對照。洗板2次。加100 μL/孔樣品稀釋液至所有的標準品孔內，將孵育后的反應體系50 μL/孔轉移至ELISA板。向各孔內加50μL樣本稀釋液，50 μL Biotin-Conjugate(1:100稀釋)，4℃過夜。次日洗板5次。加Strepavidin-HRP(1:100稀釋)，25℃孵育1 h。 洗板5次。加入 TMB 底物 100 μL/孔，25℃避光反應 15～20 min。450 nm測吸光度。

3 實驗結果

3.1 衍生小肽的氨基酸序列信息和ESI-MS質譜表征

成功合成3條衍生小肽，樣品的測量值與計算值相符合，表征正確。見表1。

表1 TNF-R1第四區衍生小肽的ESI-MS質譜分析

3.2 衍生小肽的活性篩選

小肽Pep 3顯著抑制TNF-α與TNF-R1的結合，且呈劑量依賴性關系；而Pep 1和Pep 2均未表現出抑制作用。見圖1。

圖1 衍生小肽對TNF-α與TNF-R1結合過程的影響

4 討論

該研究發現TNF-R1的CRD4區域衍生小肽Pep 3(residues145-152)能夠顯著抑制TNF-α和TNF-R1的結合。提示TNF-R1的CRD4的A1模塊區域內能夠影響TNF-α與其受體TNF-R1結合的關鍵作用區域位于Leu145至Ser152之間。有學者發現在TNF-R1上連接CRD3和CRD4的一段區域(residues 130-149)以及CRD4上的一段區域(residues 146-165)都參與了TNF-α和 TNF-R1的結合[6]。這一點與目前的研究結果在部分程度上是一致的。雖然目前尚缺乏關于Pep 3與TNF-α或TNF-R1的作用模式方面的數據，但這并不影響所推測出的結論，那就是：TNF-R1的CRD4區能夠直接參與TNF-α與TNF-R1的結合，從而影響了二者的相互作用。

[1]Kim EY,Moudgil KD.Immunomodulation of autoimmune arthritisbypro-inflammatorycytokines[J].Cytokine，2017（4）：12.

[2]Hirano T,Mori Y.Anti-atherogenic and anti-inflammatory properties of glucagon-like peptide-1,glucose-dependent insulinotropic polypepide,and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in experimental animals[J].J Diabetes Investig，2016，Suppl 1:80-86.

[3]Naismith JH,Devine TQ,Kohno T,et al.Structures of theextracellular domain of the type I tumor necrosis factor receptor[J].Structure，1996（4）:1251-1262.

[4]Takasaki W,Kajino Y,Kajino K,et al.Structure-based design and characterization of exocyclic peptidomimetics that inhibit TNF alpha binding to its receptor[J].Nat Biotechnol，1997（15）:1266-1270.

[5]Merrifield B.Solid phase synthesis[J].Science，1986（232）:341-347.

[6]Naismith JH,Devine TQ,Brandhuber BJ,et al.Crystallographic evidence for dimerization of unliganded tumor necrosis factor receptor[J].J Biol Chem，1995（270）:13303-13307.

Synthesis and Preliminary Activity Screening of TNF-α Polypeptide Inhibitors

CAO Ying-nan
Xinhua College of Zhongshan University,Guangzhou,Guangdong Province,510520 China

Objective To preliminarily study the effect of fourth functional domain CRD4-derived tripetides in extracellular region of TNF-R1 on the combination course of TNF-α and receptor TNF-R1.Methods The derived tripetide segments were designed by taking some sequences of CRD4 as models and the effect of small peptides on the combination course of TNF-α and receptor TNF-R1 was observed by the BioLISA.Results The concentrations of small peptide Pep 3 were respectively 20,40,60,80,100,and 120 μM,which could inhibit the combination of TNF-α and receptor TNF-R1,but the Pep 1 and Pep 2 had no obvious inhabitation effect.Conclusion The A1 module-derived-small peptide Pep 3 of CRD4 of TNF-R1 can effectively inhabit the combination of TNF-α and receptor TNF-R1,which reminds that the region in which the sequence is located is the key site that can influence the combination of TNF-α and receptor TNF-R1.

TNF-α;TNF-R1;CRD4;Small peptide;BioLISA

R96

A

1672-5654（2017）07（a）-0097-03

2017-04-06）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.19.097

曹穎男（1983-），女，山東煙臺人，博士，講師，研究方向:藥理學。