組蛋白去乙酰化酶抑制劑RGFP109逆轉膠質母細胞瘤U251細胞對替莫唑胺耐藥性的機制研究

管晨峰，李玉珍，張開禮，李宗陽，黃國棟#（.中山大學附屬第八醫院藥學部，廣東深圳 58000；.深圳大學附屬第一醫院神經外科，廣東深圳 58035）

組蛋白去乙酰化酶抑制劑RGFP109逆轉膠質母細胞瘤U251細胞對替莫唑胺耐藥性的機制研究

管晨峰1＊，李玉珍1，張開禮1，李宗陽2，黃國棟2#（1.中山大學附屬第八醫院藥學部，廣東深圳 518000；2.深圳大學附屬第一醫院神經外科，廣東深圳 518035）

目的：研究組蛋白去乙酰化酶抑制劑RGFP109逆轉膠質母細胞瘤U251細胞的耐藥性機制。方法：建立對替莫唑胺（TMZ）耐藥的TR/U251細胞，試驗分為正常對照組、TMZ組（40 μmol/L）和TMZ（40 μmol/L）+RGFP109（0～120 μmol/L）不同濃度組，加入相應藥物作用24 h后，CCK-8法檢測細胞存活率，計算半數抑制濃度（IC50）。TUNEL法和Annexin V/PI法檢測正常對照組、TMZ組和TMZ+RGFP109（42 μmol/L）組細胞的凋亡情況，免疫印跡法檢測3組細胞中O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）、存活蛋白（Survivin）、B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、B淋巴細胞瘤xL（Bcl-xL）蛋白表達，凝膠遷移實驗檢測3組細胞中p65乙酰化水平及其與κB-DNA的結合能力。結果：與正常對照組和TMZ組比較，TMZ+RGFP109不同濃度組細胞存活率明顯降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性。當RGFP109濃度為42 μmol/L時，TMZ對TR/U251細胞的敏感性與U251細胞相同。與正常對照組比較，TMZ組細胞中MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達均增強（P＜0.01），p65乙酰化水平無明顯變化，但p65與κB-DNA的結合能力增強（P＜0.01）。與TMZ組比較，TMZ+RGFP109組細胞中MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達均減弱（P＜0.01），p65乙酰化水平增強（P＜0.01），p65與κB-DNA的結合能力減弱（P＜0.01）。結論：RGFP109可通過下調轉錄因子κB調節的抗凋亡蛋白表達，減弱p65與κB-DNA的結合來逆轉U251細胞對TMZ耐藥。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑RGFP109；轉錄因子κB；替莫唑胺；膠質母細胞瘤U251細胞；乙酰化

膠質母細胞瘤是最常見的中樞神經系統（CNS）惡性腫瘤。烷化劑替莫唑胺（TMZ）是膠質母細胞瘤化療的主要藥物，但其耐藥性很大程度上減弱了其化療效果。研究表明，轉錄因子κB（NF-κB）的絲氨酸磷酸化水平在膠質母細胞瘤中較高，其可導致各種細胞因子和原癌蛋白的表達失調[1]。因此，抑制NF-κB的活化可能成為解決膠質母細胞瘤耐藥性問題的重要途徑。

研究發現，組蛋白乙酰化酶（HAT）和去乙酰化酶（HDAC）在NF-κB翻譯后修飾過程中發揮著重要的作用[2]。以組蛋白乙酰化和去乙酰化酶（HDAC1和HDAC3）去乙酰化為代表的可逆性進程，影響著p65與κB-DNA的相互作用，從而調節NF-κB的轉錄進程，進而可能對克服膠質母細胞瘤耐藥性產生重要影響。RGFP109是二苯胺庚二酸類HDAC1和HDAC3的選擇性抑制劑，具有良好的血腦屏障透過率，其針對帕金森病治療的應用研究已進入臨床研究階段，具有良好的應用前景。本文以膠質母細胞瘤U251細胞為研究對象，研究RGFP109逆轉U251細胞的耐藥性的機制。

1 材料

1.1 儀器

CKX41倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；后置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；Multiskan go 1510酶標儀（美國賽默飛公司）；TDL-5013臺式離心機（上海安亭科學化學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

TMZ膠囊（美國Merck Sharp&Dohme公司，批號：H20080313，規格：每粒20 mg）；RGFP109原料藥（美國Selleck公司，批號：S729201，純度：99.17%）；高糖DMEM培養基和胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；膜聯蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）/碘化丙啶（PI）檢測試劑盒（美國Invitrogen公司）；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）、存活蛋白（Survivin）；B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、B淋巴細胞瘤xL（Bcl-xL）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；NF-κB p65和乙酰化賴氨酸殘基鼠單克隆抗體（美國Abcam公司）；LightShift化學發光凝膠遷移實驗（EMSA）試劑盒（美國Pierce Biotechnology公司）。

1.3 細胞

人惡性膠質母細胞瘤U251細胞株購自中國科學院生物化學和細胞生物學研究所。

2 方法

2.1 細胞培養

將U251細胞培養于含10%FBS的DMEM培養基中（添加鏈霉素、青霉素各100 u/mL），在含5%CO2、飽和濕度的37℃恒溫培養箱中孵育，每隔3 d以0.25%胰酶消化、傳代，并取部分對數生長期細胞懸浮于含10%二甲基亞砜（DMSO）、20%FBS、70%DMEM的細胞凍存液中，置于液氮保存。

2.2 耐藥菌株的建立

采用前期研究[1]中已建立的穩定耐TMZ的U251細胞（TR/U251細胞）進行試驗，已測得TMZ對TR/U251細胞的半數抑制濃度（IC50）為（283.45±22.38）μmol/L，對親本U251細胞的IC50為（39.88±6.25）μmol/L。

2.3 分組與給藥

以TMZ對親本U251細胞的IC50為TMZ聯合用藥濃度。將TR/U251細胞分為正常對照組、TMZ組（40 μmol/L）和TMZ（40 μmol/L）+RGFP109（20、40、60、80、100、120 μmol/L）不同濃度組，通過細胞活性檢測細胞存活率，篩選實現TMZ耐藥性逆轉的RGFP109聯合用藥濃度。再將試驗進一步分為正常對照組、TMZ組、TMZ（40 μmol/L）+RGFP109（篩選所得濃度）組。

2.4 細胞活性測定

取對數生長期細胞接種于96孔板，每孔含2 500個細胞，37℃下培養24 h，按“2.3”項下分組加入含相應藥物的培養基100 μL，每組設6個復孔，作用24 h。棄原培養液，每孔添加含10%CCK-8的培養液100 μL，繼續37℃下培養2 h后酶標儀檢測450 nm波長處的光密度（OD），計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝給藥組OD值/正常對照組OD值×100%。試驗重復2次。

2.5 TUNEL法檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞種植于細胞爬片（7.5×105mL－1）上培養24 h，按“2.3”項下分組給藥，作用24 h，按照TUNEL試劑盒說明書進行染色，用后置熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況（共計200個細胞）。

2.6 AnnexinⅤ/PI法檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞種植于6孔板（7.5×105mL－1）中培養24 h，按“2.3”項下分組給藥，作用24 h，按照AnnexinⅤ/PI檢測試劑盒說明書進行染色，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.7 免疫印跡法檢測細胞中NF-κB通路相關因子的蛋白表達

取對數生長期細胞種植于6孔板（7.5×105mL－1）中培養24 h，按“2.3”項下分組給藥，作用24 h，分別加入細胞裂解液充分裂解細胞，提取蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，確定蛋白電泳上樣體積。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉移至聚偏氟乙烯膜（PVDF），5%脫脂奶粉室溫封閉，洗膜，加入一抗（1∶500）溶液中4℃孵育過夜，加入二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，漂洗。滴加增強化學發光（ECL）液后，在凝膠成像系統中曝光，用Quantity One軟件統計各抗體條帶灰度值。以MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL與內參GAPDH灰度值的比值表示對應蛋白的相對表達量。

2.8 EMSA檢測細胞中p65與κB-DNA的結合能力

取對數生長期的細胞種植于6孔板（7.5×105mL－1）中培養24 h，按“2.3”項下分組給藥，作用12 h，提取細胞核蛋白，然后按照EMSA試劑盒說明書操作，采用生物發光法進行顯色，檢測p65與κB-DNA的結合能力。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 RGFP109濃度的篩選結果

與正常對照組（細胞存活率為100%）和TMZ組比較，TMZ+RGFP109（20～120 μmol/L）不同濃度組細胞存活率明顯降低（P＜0.01），并呈濃度依賴性。當RGFP109濃度為42 μmol/L時，TMZ對TR/U251細胞的敏感性與親本U251細胞相同，因此選擇42 μmol/L作為TMZ+RGFP109組中RGFP109的濃度。TMZ+RGFP109組和TMZ組細胞存活率的測定結果見圖1。

圖1 TMZ+RGFP109組和TMZ組細胞存活率的測定結果Fig 1 Determination results of cell survival rate in TMZ+RGFP109 group and TMZ group

3.2 細胞凋亡情況

與正常對照組和TMZ組比較，TMZ+RGFP109組細胞的凋亡數明顯增加，證實RGFP109逆轉了TR/U251細胞的耐藥性，增強了TMZ的細胞毒性作用。各組細胞凋亡情況的熒光圖見圖2，流式圖見圖3。

圖2 各組細胞凋亡情況的熒光圖Fig 2 Fluorescence diagram of cell apoptosis in each group

圖3 各組細胞凋亡情況的流式圖Fig 3 Flow cytometry of cell apoptosis in each group

3.3 細胞中NF-κB通路相關因子的蛋白表達

與正常對照組比較，TMZ組TR/U251細胞中MGMT、Survivin、Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達明顯增強（P＜0.01）。與TMZ組比較，TMZ+RGFP109組TR/U251細胞中MGMT、Survivin、Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表達明顯降低（P＜0.01）。各組細胞中MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達的電泳圖見圖4，測定結果見圖5。

圖4 各組細胞中MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達的電泳圖Fig 4 Electrophoresis chart of MGMT，Survivin，Bcl-2，Bcl-xL protein expressions in cells in each group

3.4 細胞中p65與κB-DNA的結合情況

與正常對照組和TMZ組比較，TMZ+RGFP109組細胞中乙酰化的賴氨酸殘基增加，p65乙酰化水平顯著增強（P＜0.01），而p65-κ B-DNA表達明顯減弱（P＜0.01）。由此證明RGFP109導致了p65乙酰化增強，減弱了p65與其κB-DNA結合的能力，阻斷了NF-κB通路的活化。各組細胞中p65乙酰化水平及其與κB-DNA結合的電泳圖見圖6，測定結果見圖7。

4 討論

有研究顯示，NF-κB和相關腫瘤抑制基因的異常活化能促進膠質母細胞瘤細胞抵抗TMZ[2-4]。本研究結果也證明了RGFP109通過抑制NF-κB介導的轉錄后修飾克服了細胞對TMZ的抵抗性[5]。作為經典核轉錄因子，NF-κB的活化進程歷經眾多的翻譯后修飾[6-7]，其中乙酰化更是NF-κB反式激活的關鍵步驟[8-9]。因此，筆者集中探討了RGFP109介導NF-κB通路的調節機制。

圖5 各組細胞中MGMT、Survivin、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達的測定結果Fig 5 Determination results of MGMT，Survivin，Bcl-2，Bcl-xL protein expressions in cells in each group

圖6 各組細胞中p65乙酰化水平及其與κB-DNA結合的電泳圖Fig 6 Electrophoresis chart of the p65 acetylation level and its binding with κB-DNA in cells in each group

圖7 各組細胞中p65乙酰化水平及其與κB-DNA結合的測定結果Fig 7 Determination results of the p65 acetylation level and its binding with κB-DNA in cells in each group

筆者曾在預試驗中建立了多種膠質母細胞瘤細胞株，并初步觀察到RGFP109能減弱細胞株對TMZ的耐藥性以及增強TMZ誘導的細胞毒性。在本研究中，筆者使用TMZ和RGFP109共處理TR/U251細胞的方法來評估作用效果，并最終闡明了RGFP109減弱TR/U251細胞對TMZ的耐藥性以及增強TMZ誘導的細胞毒性的機制。在本研究中，筆者還發現NF-κB誘導上調的抗凋亡蛋白可能與TMZ抵抗性的增強有關，并發現RGFP109能顯著降低TR/U251細胞中NF-κB調節的抗凋亡蛋白MGMT、Survivin、Bcl-2和Bcl-xL的表達。進一步的免疫共沉淀結果分析表明，與正常對照組和TMZ組比較，TMZ+RGFP109組細胞乙酰化的賴氨酸殘基的增加，顯著增強了p65乙酰化水平。

此外，通過進一步的EMSA，證明了p65的乙酰化降低了其結合κB-DNA的能力，是導致NF-κB通路的活化受阻的重要原因。這也證明了RGFP109導致的p65乙酰化增強，減弱了p65與其κB-DNA結合的能力，阻斷了NF-κB通路的活化，進而抑制κB-靶基因的表達，導致TR/U251細胞中NF-κB調節的抗凋亡蛋白MGMT、Survivin、Bcl-2和Bcl-xL的表達水平降低，逆轉了對TMZ的化療抵抗作用。此外，RGFP109良好的血腦屏障透過作用、較強的中樞神經系統組織代謝分布作用，以及對細胞組織的低毒性，都預示著RGFP109在膠質母細胞瘤化療抵抗的逆轉過程中有著良好的臨床治療價值。

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Study on the Mechanism of Histone Deacetylase Inhibitor RGFP109 in Reversing Resistance of Glioma U251 Cells to Temozolomide

GUAN Chenfeng1，LI Yuzhen1，ZHANG Kaili1，LI Zongyang2，HUANG Guodong2（1.Dept.of Pharmacy，the Eighth Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University，Guangdong Shenzhen 518000，China；2.Dept.of Neurosurgery，the First Hospital Affiliated to Shenzhen University，Guangdong Shenzhen 518035，China）

OBJECTIVE：To study the mechanism of histone deacetylase inhibitor RGFP109 in reversing resistance of glioma U251 cells.METHODS：TR/U251 cells resistance to temozolomide（TMZ）was extrablished.The test was divided into normal control group，TMZ group（40 μmol/L）and TMZ（40 μmol/L）+RGFP109（0-120 μmol/L）different concentrations groups.After 24 h of adding into related medicines，CCK-8 was used to detect the cell survival rate and calculate the half inhibitory concentration（IC50）.TUNEL and Annexin V/PI were used to detect the cell apoptosis in normal control group，TMZ group and TMZ+RGFP109（42 μmol/L）group.Immunoblotting was used to detect the O6-methyl guanine-DNA methyltransferase（MGMT），Survivin，B lymphoma 2（Bcl-2），B lymphoma xL（Bcl-xL）protein expression；and gel migration test was used to detect the p65 acetylation level and its binding capacity with κB-DNA.RESULTS：Compared with normal control group，cell survival rate in TMZ+RGFP109 different concentrations groups was obviously decreased（P＜0.05），showing a concentration-dependent manner.When the RGFP109 concentration was 42 μmol/L，the sensitivity of TMZ to TR/U251 cells was the same with U251 cells.Compared with normal control group，MGMT，Survivin，Bcl-2，Bcl-xL protein expressions in cells of TMZ groups were enhanced（P＜0.01）；p65 acetylation level had no obvious changes，while the binding capacity of p65 and κB-DNA was strengthened（P＜0.01）.Compared with TMZ group，MGMT，Survivin，Bcl-2，Bcl-xL protein expressions in cells of TMZ groups were weakened（P＜0.01）；p65 acetylation level was enhanced（P＜0.01）；and the binding capacity of p65 and κB-DNA was weakened（P＜0.01）.CONCLUSIONS：RGFP109 can reverse the resistance of U251 cells to TMZ by down-regulating the anti-apoptotic protein expressions adjusted by transcription factor κB（NF-κB）and weakening the binding of p65 and κB-DNA.

Histone deacetylase inhibitor RGFP109；Transcription factor κB；Temozolomide；Glioma U251 cells；Acetylation

R361+.3

A

1001-0408（2017）22-3091-05

2017-02-17

2017-06-01）（編輯：鄒麗娟）

＊主管藥師。研究方向：神經腫瘤、臨床藥理學。電話：0755-83982222-30876。E-mail：guancf1117@sina.com

#通信作者：主任醫師，教授，博士。研究方向：神經內鏡、腦腫瘤基礎和臨床。電話：0755-83366388-3118。E-mail：jxgd211@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.18