牛乳頭狀瘤病毒2型貴州株L2基因克隆及生物信息學分析

張海，楊麗彥，張軍，馮旭芳，周碧君*，王開功，文明，程振濤，王偉，胡興義

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州輕工職業技術學院，貴陽 550025；3.貴州省六盤水市動物衛生監督所，貴州六盤水 553001；4.貴州省德江縣動物疫病預防控制中心，貴州德江 565200)

牛乳頭狀瘤病毒2型貴州株L2基因克隆及生物信息學分析

張海1，楊麗彥2，張軍3，馮旭芳4，周碧君1*，王開功1，文明1，程振濤1，王偉1，胡興義1

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州輕工職業技術學院，貴陽 550025；3.貴州省六盤水市動物衛生監督所，貴州六盤水 553001；4.貴州省德江縣動物疫病預防控制中心，貴州德江 565200)

為分析牛乳頭狀瘤病毒2型貴州株(BPV2-GZ01株)L2基因的分子特征，預測編碼蛋白的生物學功能，對BPV2-GZ01株L2基因進行PCR擴增、克隆及序列測定，應用生物信息學相關軟件及方法，對BPV2-GZ01株L2基因進行序列分析并對其編碼蛋白進行二級結構、三級結構、B細胞表位、保守結構域、跨膜結構域和信號肽預測。結果顯示，L2基因PCR擴增產物大小為1404 bp，編碼467個氨基酸；與參考株BPV2株、BPV2-SW01株、BPV2-AKS01株、BPV13株、BPV1株相應序列核苷酸同源性分別為99.0%、99.7%、99.3%、83.9%和75.1%，氨基酸的同源性分別為98.9%、99.6%、99.4%、89.5%和82.7%；系統進化顯示，BPV2-GZ01株L2基因與BPV2-SW01株親緣關系最近；二級結構以無規則卷曲、β-折疊和α-螺旋區域所占比例較大，預測此蛋白可能存在B細胞優勢抗原表位，無跨膜區域，無信號肽區域。本研究結果將為貴州省BPV核酸疫苗研究提供理論依據。

牛乳頭狀瘤病毒2型；貴州株；L2基因；生物信息學分析

牛乳頭狀瘤是由牛乳頭瘤病毒(Bovine papillamavirus, BPV)引起的一種體表或部分黏膜發生的慢性增生性疾病，稱為“疣”[1-2]，是牛常見的良性腫瘤疾病。BPV顆粒是直徑為55～60 nm的正二十面體，為無囊膜病毒，長度約為7000～8000 bp的雙鏈閉環超螺旋DNA分子[3]，是乳頭瘤病毒家族的成員。目前已知的有14個型基因型，還有很多假定基因型[4]。BPV L區主要有兩個開放閱讀框(ORF)L1和L2，分別編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。L2蛋白大小約為63～78 ku，在感染細胞的胞漿中合成后迅速轉運到細胞核，參與BPV的包裝。L2蛋白相對保守，其上含很多有特異性的抗原表位，可誘與不同型別的BPV抗體產生交叉中和反應，因此有學者認為針對這些抗原位點的基因疫苗可能對廣泛的乳頭瘤病毒類型產生預防的作用[5-6]。本試驗對牛乳頭狀瘤病毒2型貴州株(BPV2-GZ01株)L2基因進行了克隆和測序分析，并與國內外不同毒株進行同源性比對，繪制系統進化樹，分析不同毒株間的親緣關系，以闡明BPV2-GZ01株L2基因的分子特點；采用生物信息學軟件對L2基因編碼蛋白進行了蛋白質理化性質、B細胞表位、保守結構域、跨膜結構域、信號肽、二級結構和三級結構預測，以豐富當前BPV貴州流行株的生物信息學特征。

1 材料與方法

1.1 材料 牛乳頭狀瘤病毒2型貴州株(BPV2-GZ01株)陽性病料、大腸桿菌DH5α感受態細胞均由貴州大學動物疫病研究所保存；pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker、DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自上海生物工程公司；氨芐青霉素購自北京鼎國生物技術有限責任公司。

1.2 引物設計與合成 下載GenBank公布的各型BPV2衣殼蛋白L2基因序列進行序列比對和分析，選擇較為保守的區域設計1對引物序列，上游引物P1：5'-ATGAGTGCACGAAAAAGGGTG-3'；下游引物P2：5'-TTAGGCATCTTTCCGTTTTTTTC-3'；預期擴增片段長1404 bp，引物由上海英濰捷基公司合成。

1.3 BPV2-GZ01株L2基因擴增 采用DNA提取試劑盒抽提病毒DNA，以此模板，進行PCR擴增。PCR反應體系50 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水19 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min。擴增產物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測。

1.4 BPV2-GZ01株L2基因克隆及序列分析 回收純化目的DNA并連接至pMD19-T載體上，再轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，利用含氨芐青霉素(100 μg/mL)抗性的LB平板篩選陽性重組子。提取質粒，進行PCR鑒定。將產物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定為陽性的重組質粒命名為pMD19-T-L2，送往賽默飛世爾科技(中國)有限公司測序。利用DNAStar、Mega 5.0等軟件對測序結果進行分析，并繪制系統進化樹。參考毒株信息見表1。

1.5 BPV2-GZ01株L2基因生物信息學分析 采用在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析預測編碼蛋白質的理化性質及氨基酸組成。采用SPOMA在線服務器(https: //npsa-prabi.ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/ npsa_sopma. html)預測蛋白質二級結構；采用DNAStar軟件Protean程序預測B細胞表位多參數；采用NCBI服務器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART)工具(http://blast .ncbi. nlm.nih.gov.Blast)預測保守結構域；采用TMHMM2.0 Server在線服務器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測跨膜結構域；采用SignalP4.1在線服務器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽。利用SWISSMODEL(http://www.swissmodel.expasy.org)在線預測蛋白質的三級結構。

2 結果與分析

2.1 BPV2-GZ01株L2基因PCR擴增 以提取的BPV2-GZ01株病毒DNA為模板，進行L2基因特異性PCR擴增，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到大小為1 404 bp的條帶(圖1)，與預期結果相符。

2.2 測序結果 將鑒定的陽性重組質粒進行測序，測序結果采用DNAStar軟件進行序列拼接，獲得BPV2-GZ01株L2基因核苷酸序列，由圖2可知，L2基因核苷酸序列長為1404 bp，編碼467個氨基酸。

M：DL2000 DNA Marker；1-2：擴增產物；3: 陰性對照M: DL2000 DNA Marker；1-2: Amplification products；3: Negative control圖1 BPV2-GZ01株L2基因PCR擴增電泳圖Fig 1 Amplification of L2 gene of BPV2-GZ01 by PCR

2.2.1 BPV2-GZ01株L2基因核苷酸同源性分析

將本試驗克隆的BPV2-GZ01 L2基因序列與GenBank上公布的16株牛乳頭狀瘤病毒L2基因的對應序列進行核苷酸比對分析(圖3)。

結果顯示，BPV2-GZ01 L2基因序列與牛乳頭狀瘤病毒2型的核苷酸序列同源性為99.0%～99.7%，其中與BPV2-SW01(登錄號：KC878306)的同源性最高達到99.7%；與NCBI收錄的另外兩株BPV13(登錄號：JQ79817)、BPV1(登錄號：X02346)的同源性分別為83.9%、75.1%。

圖2 BPV2-GZ01株L2基因測序結果Fig 2 Secquencing result of L2 gene of BPV2-GZ01

圖3 BPV2-GZ01株L2基因的核苷酸同源性分析Fig 3 Nucleotide homology analysis of L2 gene of BPV2-GZ01

2.2.2 BPV2-GZ01株L2基因編碼蛋白的氨基酸同源性分析 采用DNAStar軟件分析出BPV2-GZ01 L2基因的氨基酸序列，并與GenBank中公布的16株牛乳頭狀瘤病毒L2基因編碼氨基酸序列作同源性分析(圖4)。結果顯示，BPV2-GZ01 L2基因氨基酸序列與牛乳頭狀瘤病毒2型的氨基酸序列同源性為98.7%～99.6%，其中與BPV2-ASK01(登錄號：KC878306)的同源性最高達到99.6%；與NCBI收錄的另外兩株BPV13(登錄號：JQ79817)、BPV1(登錄號：X02346)的同源性分別為89.5%、82.7%。

2.2.3 BPV2-GZ01株L2基因系統進化樹分析 將BPV2-GZ01株L2基因與國內外發表的BPV不同毒株L2基因的核苷酸序列采用DNAStar軟件繪制遺傳進化樹。結果顯示，BPV2-GZ01株與BPV2、BPV2-SW01、BPV2-AKS01株都處在同一遺傳進化分支(圖5)，其中BPV2-SW01株的親緣關系最近。BPV2-GZ01株與BPV13和BPV1的親緣關系較近。

圖4 BPV2-GZ01株L2基因編碼蛋白的氨基酸同源性分析Fig 4 Amino acid homology analysis of L2 gene of BPV2-GZ01

圖5 BPV2-GZ01株L2基因核苷酸序列的系統進化樹Fig 5 Phylogenetic tree of L2 gene BPV2-GZ01 on nucleotide sequence

2.3 BPV2-GZ01株L2蛋白質理化性質的分析 使用ExPASy(Compute PI/MW)、ProtParam在線分析軟件預測蛋白質的理化性質及氨基酸組成。L2蛋白分子質量為49.41127 ku，分子結構式為C2183H3456N596O702S4，理論等電點(PI)為4.85。其氨基酸組成中Gly(G)和Leu(L)最多，均占到9.1%以上，不含Pyl(0)和Sec(U)。在該蛋白的氨基酸中，堿性氨基酸有3種(Arg、Lys、His)，共45個，占9.6%；酸性氨基酸有2種(Asp、Glu)，共56個，占12%；親水性氨基酸有6種(Asp、Glu、His、Lys、Ser、Thr)，共159個，占34.1%；疏水性氨基酸9種(Ala、Ile、Pht、Leu、Met、Pro、Val、Trp、Tyr)，共207個，占44.33%，推測L2蛋白為堿性蛋白。L2蛋白在哺乳動物網狀細胞、酵母和埃希氏大腸桿菌中表達的半衰期分別大于30 h、20 h和10 h，在溶液中的不穩定指數為43.74，高于閾值40，屬于不穩定類蛋白[7]。

2.4 BPV2-GZ01株L2基因B細胞表位預測

2.4.1 L2基因編碼蛋白二級結構預測 采用SOPMA在線服務器預測L2基因編碼蛋白的二級結構，結果見圖6。BPV2-GZ01株L2基因編碼蛋白的二級結構主要包括α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和β-折疊，所占比例分別為19.06%、8.78%、49.89%和22.27%。在整個蛋白二級結構中無規則卷曲、β-折疊和α-螺旋區域出現相對較多，而此序列中β-轉角所占比例相對較少。

2.4.2 L2基因編碼蛋白B細胞多參數分析 采用DNAStar程序包中的Protean軟件綜合分析預測L2基因編碼蛋白B細胞表位各參數。采用Kyte-D00little法分析親水性，Karplus-Schulz法分析柔韌性Jameson-Wolf法分析抗原指數和Emini法分析氨基酸表面可及性進行分析，以高于閾值的氨基酸殘基作為候選參考區域，結果見圖7。由圖可知，該蛋白在整個氨基酸區域中，都具有良好的親水性，柔韌性分布較均勻，抗原性和表面可及性較高。

h：α-螺旋；t：β-轉角；c，無規則卷曲；e：β-折疊h：Alpha helix；t：Beta turn；c：Random coil；e：Extended strand圖6 BPV2-GZ01 L2基因編碼蛋白二級結構預測Fig 6 Secondary structure prediction of BPV2-GZ01 L2 protein

圖7 BPV2-GZ01 L2蛋白B細胞表位參數預測Fig 7 B cell epitope prediction for L2 protein of BPV2-GZ01 by the DNAStar method

2.5 BPV2-GZ01株L2基因編碼蛋白保守結構域預測 采用NCBI服務器上的CDART工具分析L2基因氨基酸序列保守結構域，沒有發現具有明顯特征的保守結構域(圖8)。

圖8 BPV2-GZ01 L2基因編碼蛋白保守結構域分析Fig 8 Conserved domain analysis of L2 protein of BPV2-GZ01

2.6 BPV2-GZ01株L2基因編碼蛋白的跨膜結構預測 采用TMHMM2.0 Server在線服務器對L2蛋白跨膜結構域進行預測和分析。圖9結果顯示，BPV2-GZ01 L2基因編碼蛋白有跨膜結構域。

圖9 L2蛋白跨膜結構域預測Fig 9 Prediction of trans membrane domains of L2 protein

2.7 BPV2-GZ01株L2基因編碼蛋白信號肽預測

采用SignalP4.1在線服務器對L2蛋白序列中是否存在潛在的信號肽進行預測。預測結果顯示，此蛋白無信號肽(圖10)，即為非分泌蛋白。

圖10 L2蛋白信號肽預測Fig 10 The signal peptide analysis of L2 protein

2.8 L2基因編碼蛋白三級結構預測 利用SWISS-MODEL預測了L2基因編碼蛋白的三級結構，結果見圖11。

圖11 BPV2-GZ01 L2基因編碼蛋白三級結構預測Fig 11 Tertiary structure prediction of BPV2-GZ01 L2 protein

3 討 論

近年來，貴州省極力打造生態畜牧業大省，其中養牛業為重點發展項目之一，為加快肉牛品改進程，從2015年來先后向國外和省外引進了大量優質種牛，以快速發展養牛業，自從2016年初發現BPV以來犢牛的發病率有逐漸上升的趨勢，對養牛業造成了較大的經濟損失。由于BPV種屬特異性高，難以進行體外培養[8]。BPV基因型很多，不同的基因型引起臨床發病的部位各不相同[9-10]。到目前為止依舊沒有有效的的疫苗來預防牛乳頭狀瘤病的發生[10-12]。以抗原表位為基礎的表位疫苗具有針對性強，毒副作用小等優點已成為疫苗研制的熱點和趨勢[13]。而利用生物信息學的方法對抗原表位的預測也是較為實用、簡便的方法之一[14]。因此BPV2-GZ01株L2基因的生物信息學分析對BPV疫苗的研究有非常重要的意義。

本研究根據GenBank公布的牛乳頭狀瘤病毒2型L2基因序列，設計特異性引物，從BPV2-GZ01株中克隆該基因，經質粒鑒定及DNA測序驗證克隆成功。本研究測序結果顯示，BPV2-GZ01基因序列全長為1404 bp，編碼467個氨基酸。BPV2-GZ01株L2基因與NCBI收錄的16株毒株核苷酸和氨基酸同源性分析，BPV2-GZ01 L2基因序列與其中3株牛乳頭狀瘤病毒2型核苷酸和氨基酸序列同源性高達99.0%～99.7%和98.7%～99.6%，其中與BPV2-SW01同源性最高，為99.7%和99.6%；與NCBI收錄的另外2株BPV13、BPV1的核苷酸和氨基酸同源性分別為83.9%、75.1%和89.5%、82.7%。從系統進化樹可以看出，BPV2-GZ01株與BPV2-SW01親緣關系最近，與BPV13、BPV1和BPV14的親緣關系也比較近，同屬于Delt屬。

BPV2-GZ01株L2蛋白二級結構預測結果顯示，無規則卷曲和β-折疊占70.16%，β-轉角和α-螺旋占29.84%。蛋白質的二級結構是抗原表位的基礎，ɑ螺旋和β折疊不適合做抗原表位，該結構具有穩定高、不易變形的特性，因此是構成蛋白質骨架的主要結構；而轉角和無規則卷曲形成抗原表位的可能性增加，因為該結構易發生扭曲和盤旋[15]。當然預測一個蛋白的生物學特征時，單一參數的預測結果正確率往往是很有限的，還需綜合考慮跨膜結構、信號肽、親水性、表面可及性、抗原指數及柔韌性等預測結果來作出分析[16]。隨著生物信息學技術的不斷發展，比較全面的預測蛋白質的生物學特征已成為可能。L2蛋白氨基酸的親水性、表面可及性、抗原指數及柔韌性均較高，提示該蛋白具有較好的免疫原性，可初步應用于免疫學的相關研究中。綜合保守結構域、信號肽和跨膜結構域分析發現，BPV2-GZ01 L2蛋白無特征性功能結構域和信號肽，有跨膜結構域，即L2蛋白為二次跨膜蛋白和非分泌型蛋白[17]。氨基酸的二級結構是高級結構的基礎，同時也對高級結構的形成產生一定的影響[18-19]。通過蛋白質的三級結構預測為BPV2-GZ01 L2基因抗原表位的分析提供了更為直觀的分子模型，增加了B細胞抗原表位預測的可靠性。以上的試驗和模擬數據為進一步解析該基因功能打下堅實的理論基礎和支撐，對后期基因表達和核酸疫苗研制的研究提供試驗參考。

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(編輯：李文平)

Cloning and Bioinformatic Analysis of L2 Gene of BPV2 from Guizhou Province

ZHANG Hai1, YANG Li-yan2, ZAHGN Jun3, FENG Xu-fang4, ZHOU Bi-jun1*, WANG Kai-gong1, WEN Ming1, CHENG Zhen-tao1, WANG Wei1, HU Xing-yi1

(1.College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang, 550025, China；2.Guizhou Light Industry Vocational and Technical College Guiyang, 550025, China; 3.Animal Health Supervision Institute of Liupanshui City, Lupanshui, Guizhou, 553001, China；4.Dejiang County Animal Disease Prevention and Control Center, Dejiang, Guizhou 565200, China)

ZHOU Bi-jun, E-mail：as.bjzhou@gzu.edu.cn

In order to study and analyze the L2 gene of Bovine papillamavirus 2 in Guizhou province, the L2 gene of BPV2-GZ01 strain was amplified, cloned and sequenced using bioinformatic softwares and methods, the secondary structure, tertiary structure, B-cell preponderant epitope, conserved domains analysis, transmembrane domain and signal peptide of L2 gene were predicted. The results indicated the length of L2 gene was 1404 bp, encoding 467 amino acids. The L2 gene of BPV2-GZ01 strain shared a nucleotide identities of 99.0%、99.7%、99.3%、83.9% and 75.1%, and an amino acid identities of 98.9%、99.6%、99.4%、89.5% and 82.7% with those of strains BPV2, BPV2-SW01, BPV2-AKS01, BPV13 and BPV1, respectively. The results of phylogenetic tree analysis indicated that there was a close relationship between BPV2-GZ01 strain and BPV2-SW01. Prediction of the secondary structure of L2 indicated that the random coil, extended strand and alphahelix took a higher percentage. The L2 protein was supposed contain antigen epitopes, and have a transmembrane domains, no signal peptide found. Tertiary structure is curved spiral structure. These results provided a theoretical basis for further research of nucleic acid vaccine of BPV.

Bovine papillamavirus 2(BPV2)；Guizhou strain；L2 gene；bioinformatics analysis

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.03

貴州省黔南州社會發展科技重大計劃項目[黔南社發科(20140325)]；貴州省農業委員會科技專項(黔農財[2015]149號)

張海，碩士研究生，從事動物傳染病學研究。

周碧君。E-mail: as.bjzhou@gzu.edu.cn

2017-03-30

A

1002-1280 (2017) 08-0014-09

S852.65