MTHFR基因C677T多態性與單藥抗癲癇療效的相關性研究

林 芳，任 陽

MTHFR基因C677T多態性與單藥抗癲癇療效的相關性研究

林 芳，任 陽

目的 探討中國北方漢族人群中，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因多態性與抗癲癇藥物(AEDs)單藥治療療效的關系。方法 根據隨訪結果，在接受卡馬西平單藥治療的癲癇患者中，隨機選擇治療有效患者50例，治療無效患者50例，同樣方法選擇接受苯妥英鈉和丙戊酸單藥治療的癲癇患者各100例。選擇同期新診斷癲癇且尚未服藥的50例患者作為病例對照組，選擇非癲癇患者50例作為健康對照組。采用熒光偏振免疫法檢測血同型半胱氨酸(HCY)，采用聚合酶鏈反應-限制性內切酶分析(PCR-RFLP)法比較MTHFR基因多態性。結果 接受任意一種AEDs單藥治療的癲癇患者，與病例對照組和健康對照組比較，血HCY濃度差異均有統計學意義(P<0.05)；病例對照組血HCY濃度和健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。接受AEDs單藥治療的癲癇患者，治療有效組基因型和等位基因的分布頻率與無效組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；癲癇患者基因型和等位基因分布頻率與健康對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。接受AEDs單藥治療的癲癇患者，不同血HCY濃度組的MTHFR基因型和等位基因分布差異有統計學意義。結論 MTHFR基因C677T位點突變和AEDs均可影響血HCY濃度，對于接受AEDs單藥治療的癲癇患者，MTHFR基因C677T多態性與治療療效相關。

癲癇；亞甲基四氫葉酸還原酶；抗癲癇藥物；基因多態性

0 引言

近年研究發現，多種抗癲癇藥物(Antiepileptic drugs，AEDs)可導致患者血同型半胱氨酸(Homocysteine，HCY)的濃度升高，降低癲癇患者血清HCY濃度可減少癲癇發作，提示血清HCY水平可能與癲癇發作相關[1-2]。亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetra hydrofolate reductase，MTHFR)作為調節血清HCY濃度的主要成分之一，其基因包括C677T和A1298C 2個突變位點，而C677T突變與血清HCY濃度關系較為密切[3-4]。因此，本研究假設MTHFR基因C677T多態性可通過影響血清HCY水平，進而對AEDs抗癲癇療效造成影響，并對此進行觀察分析，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2012年1月至2016年6月在我科門診或住院治療的癲癇患者，隨機選擇50例接受卡馬西平治療有效和50例治療無效的患者分別納入有效組和無效組。AEDs治療有效評價標準：接受規范單藥治療1年內癲癇未發作，或發作次數減少≥50%。治療無效評價標準：①接受AEDs規范單藥治療≥1年；②檢測血藥濃度已達到有效濃度，或已使用最大藥物劑量時，癲癇發作減少不超過50%。在同期接受苯妥英鈉或丙戊酸單藥治療的癲癇患者中，按照相同方法隨機選擇有效組和無效組患者。另外，隨機選擇在我院體檢的非癲癇人員50例作為對照組。

入組人員年齡滿18周歲，除外嚴重肝腎功能不全、嚴重營養不良、重度貧血或接受過器官移植者，以及近3個月內口服過葉酸、維生素B12等影響血清HCY濃度藥物者。本研究通過本院倫理委員會審核批準，所有入組人員均充分知情同意。

1.2 血HCY及藥物濃度檢測 本研究所有血HCY及藥物濃度檢測均由本院檢驗科完成，其中血HCY檢測采用熒光偏振免疫法(Fluorescence Polarization Immunoassay，FPIA)進行檢測。血AEDs濃度采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)進行檢測。

1.3 基因多態性檢測 采集清晨空腹時外周靜脈血2 mL，按照氯仿飽和酚法提取基因組DNA，采用聚合酶鏈反應-限制性片段多態性(Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)法檢測MTHFR基因多態性。PCR反應體系(25 μL)包括：10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物各1 μL(上游引物：5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′，下游引物：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′)，dNTP混合物2 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，模板DNA 1 μL，不足部分由滅菌蒸餾水補足。反應條件為95 ℃預變性4 min，然后按照95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s順序循環30個周期，最后72 ℃延長3 min。將擴增產物分別使用限制性內切酶HinfⅠ進行酶切，酶切體系(20 μL)包括：PCR產物17 μL，10×Buffer 2 μL和內切酶1 μL，反應條件為37 ℃ 16 h，然后65 ℃ 10 min終止反應。最后取酶切產物進行電泳，紫外燈下觀察并攝片。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件分析處理，計數資料以構成百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。基因型分布采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組基本臨床特征比較 各組在年齡、性別、體重指數、癲癇類型等方面差異均無統計學意義(P均>0.05)；接受卡馬西平、苯妥英鈉或丙戊酸任意一種AEDs單藥治療的癲癇患者，包括有效組和無效組，與病例對照組比較，血HCY濃度差異均有統計學意義(P<0.05)，與健康對照組比較，血HCY濃度差異也均有統計學意義(P<0.05)；但病例對照組和健康對照組患者血HCY濃度比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 基因分型及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果 如圖1，人群中MTHFR基因包括3種基因型，分別為純合野生型(CC型)、雜合突變型(CT)及純合突變型(TT)。本研究對象基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，其基因頻率已達到遺傳平衡，具有群體代表性，見表2。

圖1 MTHFR基因C677T位點分型結果

2.3 基因型和等位基因分布 見表2。等位基因模型(C/T)和隱性模型(CC/CT+TT)顯示，接受AEDs單藥治療的癲癇患者，有效組基因分布頻率與無效組差異有統計學意義(P<0.05)。將所有癲癇患者共350例合并為癲癇組，比較癲癇組基因型和等位基因分布頻率與健康對照組的差異，結果顯示差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.4 MTHFR基因多態性與AEDs單藥治療血HCY的關系 不同血HCY濃度組的基因分布差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 各組基本臨床特征比較(例，%)

注：PS：單純部分性發作，GS：全面性發作，PGS：以全面性發作為主。*與病例對照組比較，P<0.05；#與健康對照組比較，P<0.05

表2 MTHFR基因型和等位基因分布(例，%)

表3 MTHFR基因多態性與ADEs單藥治療血HCY的關系(例,%)

3 討論

目前，癲癇已經成為神經科最主要的疾病之一，嚴重威脅我國公民的生命健康安全[5]。卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸均是目前抗癲癇的常用藥物，近年來，相繼有研究發現這3種AEDs均可導致血HCY濃度升高[2]。接受AEDs治療的癲癇患者血HCY升高可能包括兩方面因素：AEDs的藥物作用導致HCY升高；癲癇疾病本身可能導致血HCY水平升高。本研究結果顯示，未接受AEDs治療的癲癇患者與非癲癇對照組比較，血HCY濃度無顯著差異，而接受AEDs治療的癲癇患者血HCY水平顯著升高，提示應用AEDs治療的藥物作用是該人群血HCY升高的主要因素。

有研究發現，AEDs可通過抑制MTHFR酶活性，以減少HCY代謝分解，進而使其血漿水平升高[6-7]。還有研究發現，MTHFR基因C677T突變也可導致其活性改變，影響HCY代謝過程，導致HCY升高[3-4,8]。本研究結果顯示，300例接受AEDs治療的癲癇患者中，突變型患者血漿HCY水平較高，提示基因因素對接受AEDs治療的癲癇患者的血HCY水平變化具有重要影響。

HCY是半胱氨酸的異種，在旁鏈巰基部前包含1個額外的亞甲基，是蛋氨酸代謝過程的重要中間產物。研究顯示，HCY轉化代謝途徑包括：①通過葉酸循環途徑，以甲基四氫葉酸作為甲基供體，維生素B12為輔因子，甲基化為L-蛋氨酸；②通過轉硫過程，形成代謝產物進入三羧酸循環[9-10]。當兩條代謝途徑受到影響時，可導致HCY在血中升高。目前研究發現，高HCY與多種疾病和病理過程相關，包括動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、神經管畸形等[11]。近年來，相繼有動物實驗和臨床研究發現，降低血HCY濃度可減少癲癇發作[2,12-13]，提示HCY可能與癲癇的發病和預后相關。MTHFR是HCY代謝的關鍵酶，多個基因位點的突變均可導致MTHFR穩定性下降，造成HCY代謝障礙，進而在體內蓄積，C677T突變是目前研究最多的位點之一[14-15]。推測MTHFR基因C677T突變可能與癲癇患者的預后相關，尤其對于接受AEDs治療的癲癇患者，其本身合并導致HCY升高的因素，MTHFR基因C677T突變可能與其治療效果也密切相關。

本研究結果顯示，癲癇組和健康對照組比較，MTHFR基因的基因型和等位基因頻率無顯著差異，但接受卡馬西平、苯妥英鈉和丙戊酸任意一種AEDs治療的癲癇患者，治療有效組(CT+TT)基因型和T等位基因頻率均較無效組小，提示C677T突變可能與AEDs治療療效相關，與本研究所提出的假設相印證。

綜上所述，MTHFR基因C677T位點突變和AEDs均可影響血HCY濃度，對于服用AEDs單藥治療的癲癇患者，C677T突變與治療療效相關。目前關于降低HCY、MTHFR基因多態性對癲癇發作的確切作用機制和分子功能均未明確，需要進一步從研究方法、研究對象選擇等方面制訂更為統一的標準，完善研究結果。另外，MTHFR基因多態性與其他基因以及其他作用因素相互作用的具體機制仍需進一步研究。

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Study on correlation between MTHFR gene (C677T) polymorphism and the efficacy of monotherapy with antiepileptic drug

LIN Fang,REN Yang

(Department of Geriatrics,Affiliated Hospital of Yan′an University,Yan′an 716000,China)

Objective To discuss the correlation between the polymorphism of Methylene Tetrahydrofolate Reductase (MTHFR) gene and the efficacy of monotherapy of Antiepileptic Drug (AEDs) in the Han descent population in the North of China.Methods According to the follow-up results,100 epileptics who were randomly selected from the carbamazepine monotherapy group were divided into effective group (n=50) and ineffective group (n=50) based on the efficacy.Meanwhile,100 epileptics were randomly selected from the phenytoin sodium monotherapy group or valproic acid group respectively and grouped according to the same method.Fifty epileptics who were newly-diagnosed and had not

AEDs therapy were recruited as case-control group,and 50 healthy people were recruited as healthy-control group.Plasma homocysteine (HCY) was measured by fluorescence polarization immunoassay.Polymorphism of MTHFR was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).Results There were significant differences in the plasma concentration of HCY between AEDs monotherapy group and control groups (P<0.05).However,there was no significant difference in the plasma concentration of HCY between case-control group and healthy-control group (P>0.05).Among the epileptics who receive monotherapy of AEDs,there were significant differences in the genotype and the variation of allele frequencies between effective group and ineffective group (P<0.05);however,no significant difference was found in the frequency distribution of the genotypes and alleles between case-control group and healthy-control group (P>0.05).Among epileptics who received monotherapy of AEDs,there were significant differences in frequency distribution of the genotypes and alleles among groups of different HCY concentration in plasma.Conclusion Both gene polymorphism of MTHFR (C677T) and AEDs play a role in the concentration of HCY in plasma.For the epileptics who receive monotherapy of AEDs,polymorphism of the MTHFR (C677T) may be related to the efficacy of AEDs.

Epilepsy;Methylenetetra hydrofolate reductase;Antiepileptic drugs;Gene polymorphism

2016-11-08

延安大學附屬醫院老年病科，延安 716000

10.14053/j.cnki.ppcr.201708011