醬油揮發性成分固相微萃取條件的優化

劉非，杜麗平，肖冬光

(天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457)

醬油揮發性成分固相微萃取條件的優化

劉非，杜麗平，肖冬光

(天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457)

頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)是提取揮發性成分比較常用的方法。為了確定提取醬油揮發性成分的SPME萃取頭，分別以揮發性成分的累積峰面積標準化值和峰面積相對標準偏差的平均值與標準偏差為指標，考察了不同型號萃取頭的萃取靈敏度和重復性，確定采用65μm PDMS/DVB提取醬油揮發性成分；并以各類揮發性成分峰面積和總峰面積為指標，優化了其萃取條件，確定萃取條件為：樣品用量8 mL，萃取溫度60 ℃，萃取時間60 min。利用優化方法對醬油揮發性成分進行提取，經氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析，共鑒定出86種揮發性成分，其中最主要的為酯類物質，其次為醇類、醛類和酸類。揮發性成分峰面積的平均相對標準偏差為8.14%，方法重復性較好。

頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)；醬油；揮發性成分；靈敏度；重復性；優化

醬油主要是以大豆、小麥等為原料，通過微生物的發酵作用，形成具有特殊色澤、香氣、味道和狀態的調味品[1]。醬油中含有多種揮發性成分，包括醇類、酯類、酸類、酮類、醛類和酚類等，這些成分雖然含量很少，但對其風味有很大影響[2]。若對醬油揮發性成分進行分析，首先應將成分提取出來。由于其揮發性成分復雜、含量低，只有選擇合適的提取方法，才能夠全面、正確地反映出醬油揮發性成分的組成。目前，常用的醬油揮發性成分提取方法主要為液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)[3]，液液微萃取(liquid-liquid microextraction, LLME)[4]，同時蒸餾萃取(simultaneous distillation-extraction, SDE)[5]， 熱脫附[6]和固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)[7-8]等。與其他提取方法相比，SPME具有操作簡單、無需溶劑、提取效果好、變異系數小、低樣品用量等優點[9]，在揮發性成分的分析中被廣泛應用，其中SPME萃取頭是影響揮發性成分提取的重要因素，目前常用的萃取頭包括：100 μm PDMS、85 μmPA、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/PDMS/CAR等型號，研究者多以揮發性成分的總峰面積或總峰面積和種類數為指標，分析不同型號萃取頭對醬油揮發性成分的萃取效果，然后選取萃取頭，但研究結果有一定差異。劉貞誠[10]等采用100 μm PDMS和65 μm PDMS/DVB對醬油揮發性成分進行萃取，結合GC-MS分析，結果顯示：65 μm PDMS/DVB萃取效果更佳；陳敏[11]等利用85 μm PA、75 μm CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB分別萃取醬油揮發性成分，經GC-MS分析，其中75 μm CAR/PDMS的萃取效果較佳。YAN[12]等選用以上5種型號萃取頭分別萃取醬油揮發性成分，通過GC-MS分析，確定85 μm PA為較適萃取頭。在研究SPME萃取頭對揮發性成分萃取效果方面，通過對比考察不同型號萃取頭對揮發性成分的萃取靈敏度和重復性，可以更全面客觀地了解到不同型號萃取頭對各揮發性成分的萃取效果[13-15]。本研究先通過考察不同型號SPME萃取頭對醬油揮發性成分的萃取靈敏度和重復性，選取萃取頭，并以各類揮發性成分峰面積和總面積為指標，優化了醬油用量、萃取溫度和時間等萃取條件，為醬油揮發性成分的分析奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

市售生抽醬油(產于廣東省佛山市)；正構烷烴混標(C8-C40，色譜純，上海Sigma-Aldrich公司)；NaCl(分析純，天津市化學試劑一廠)。

1.2儀器與設備

IT-09A5磁力攪拌器，上海一恒科學儀器有限公司；固相微萃取裝置(SPME手柄、100 μmPDMS、85 μmPA、75 μmCAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/PDMS/CAR萃取頭)，美國Supelco公司；7890A-5975C GC-MS聯用儀、HP-5MS石英毛細管柱(60 m×320 μm×0.25 μm)，美國安捷倫公司。

1.3實驗方法

1.3.1 揮發性成分的萃取

取8 mL醬油至20 mL頂空瓶中，加3 g NaCl，立即密封頂空瓶。將樣品瓶置于60 ℃水浴中平衡10 min，插入裝有纖維頭的手動進樣器，萃取50 min后，取出萃取頭插入GC進樣口中于250 ℃解吸附5 min。

1.3.2 萃取頭靈敏度和重復性的評價

各類揮發性成分的萃取靈敏度以累積峰面積標準化值(cumulative area normalization value, CANV)為考察指標進行評價[13]，計算方法如下：

AVK= [AK (PDMS)+ AK (PA)+AK (CAR/PDMS)+AK (PDMS/DVB)+AK (DVB/PDMS/CAR)]/5

(1)

NAK(X)= AK(X)/AVK

(2)

(3)

式中：AK(X)為萃取頭“X”萃取到揮發性成分“K”的峰面積絕對值；AVK為5種萃取頭萃取到揮發性成分“K”的峰面積平均值；NAK(X)為萃取頭“X”萃取到揮發性成分“K”的峰面積標準化值；CAK(X)為萃取頭“X”萃取到的一類揮發性成分中1～K個成分的累積峰面積標準化值。

選取能被不同型號萃取頭都萃取分析的揮發性成分，然后通過這些成分的絕對峰面積相對標準偏差的平均值和標準偏差對各萃取頭進行重復性評價。

1.3.3 HS-SPME萃取頭的選擇

按照1.2.1方法，分別采用5種型號萃取頭進行揮發性成分的萃取(每種萃取頭做5個平行)，對比考察不同型號萃取頭的靈敏度和重復性，選取二者均較佳的萃取頭，進行下一步實驗。

1.3.4 萃取條件優化

確定萃取頭后，對醬油用量(4、6、8和10 mL)、萃取溫度(40、50、60、70 和 80 ℃)和萃取時間(30、40、50、60和70 min)等條件進行優化。

1.3.5 GC-MS分析條件

GC條件：進樣口溫度250 ℃，不分流模式；載氣為高純氦氣(>99.999 9%)，流速1 mL/min； HP-5MS(60 m×320 μm×0.25 μm)石英毛細管柱的升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃ /min升到120 ℃，保持2 min，然后以7 ℃ /min升到230 ℃，保持10 min。

MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV；連接口溫度：280 ℃：質量掃描范圍30～500 amu。

1.3.6 定性方法

揮發性成分經NIST08標準譜庫(檢索結果匹配度大于等于80%)和保留指數對比進行鑒定。

2 結果與分析

2.1萃取頭的選擇

2.1.1 不同型號萃取頭靈敏度的比較

5種型號萃取頭萃取到的醬油揮發性成分經GC-MS分析，共鑒定出醇類、酸類、酯類、醛類、酮類、呋喃類、酚類、碳氫類(即烴類)、含氮類和含硫類等10類成分，而不同型號萃取頭對醬油各類揮發性成分表現出明顯不同的萃取效果。先以各類揮發性成分的累積峰面積標準化(CANV)值為指標，比較不同型號萃取頭對各類揮發性成分的萃取靈敏度。由圖1可知， 65 μm PDMS/DVB幾乎對每一種成分都顯示出較高的NAK值，對每一類成分顯示較高的CANV值，說明其對各類揮發性成分均有很強的萃取靈敏度。與65 μm PDMS/DVB相比，50/30 μm DVB/PDMS/CAR和75 μm CAR/PDMS對各類揮發性成分的萃取靈敏度較低。而85 μm PA和100 μm PDMS對各類揮發性成分都顯示出了很低的萃取靈敏度，故不再對二者進行重復性考察。

圖1 五種萃取頭萃取醬油各類揮發性成分累積峰面積標準化值Fig.1 The CANV for different catagories of soy sauce volatile compounds extracted by five fibers

2.1.2 不同型號萃取頭重復性的比較

65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/PDMS/CAR和75 μm CAR/PDMS三種萃取頭都萃取到的揮發性成分為60種，通過比較這些成分絕對峰面積相對標準偏差(RSD)的平均值和標準偏差，對萃取頭的重復性進行評價。RSD平均值和RSD標準偏差如圖2所示。經比較顯示，65 μm PDMS/DVB的RSD平均值和RSD標準偏差均最小，表現出較好的重復性。

圖2 三種萃取頭萃取揮發性成分的RSD平均值和RSD標準偏差Fig.2 Average and standard deviation of RSD of volatile compounds extracted by three fibers

根據不同型號萃取頭靈敏度和重復性的比較結果，選取65μm PDMS/DVB為萃取醬油揮發性成分的萃取頭。醬油揮發性成分分析不僅與萃取頭有關，可能與所采用的色譜柱也有很大關系，劉貞誠[10]等利用非極性色譜柱DB-5MS，以揮發性成分的總峰面積為指標，比較了100μm PDMS和65μm PDMS/DVB的萃取效果，65μm PDMS/DVB表現了更佳的萃取效果；陳敏[11]等利用中極性色譜柱DB-17MS，通過比較85μm PA、75μm CAR/PDMS和65μm PDMS/DVB等3種型號萃取頭萃取的揮發性成分總峰面積和種類數，選取75μm CAR/PDMS為萃取醬油揮發性成分的萃取頭；YAN[12]等采用極性色譜柱DB-WAX，以揮發性成分的總峰面積和種類數為指標，考察了5種與本實驗型號相同的萃取頭對醬油揮發性成分的萃取效果，經比較分析，選用85μm PA作為實驗用萃取頭。由此可見，不同極性色譜柱對揮發性成分的分析效果存在差異，使同一萃取頭提取物呈現不同的分析結果，影響實驗結果。此外，不同醬油樣品中揮發性成分組成不同，則萃取頭上的競爭性吸附發生在不同組分之間，影響萃取頭的選擇。

2.2萃取條件優化

由圖3可知，隨著醬油用量的增加，各類揮發性成分的峰面積不斷升高，當醬油用量達到8 mL時，它們的峰面積及總峰面積達到最高值，隨醬油用量繼續增加，它們的峰面積及總峰面積均降低。萃取溫度的升高使各類揮發性成分的峰面積逐漸升高，當萃取溫度為60 ℃時，除酚類外，其他各類成分的峰面積及總峰面積均達到最高值，而酚類的峰面積在70 ℃達到最大，隨著溫度的繼續升高，各類成分的峰面積以及總峰面積呈現逐漸降低的趨勢。各類揮發性成分的峰面積隨著萃取時間的增加而升高，當萃取時間為60 min時，它們的峰面積及總峰面積均達到最高，當萃取時間超過60 min時，它們的峰面積及總峰面積明顯降低。綜合考慮，確定萃取條件為醬油用量8 mL，萃取溫度60 ℃和萃取時間60 min。

圖3 醬油用量、萃取溫度和時間對醬油揮發性成分萃取的影響Fig. 3 Effect ofthe volume of soy sauce, temperature and time on the extraction of volatile compounds of soy sauce

2.3方法重復性實驗

采用優化HS-SPME方法對醬油樣品揮發性成分進行提取，然后經GC-MS分析，總離子流色譜圖如圖4，揮發性成分絕對峰面積的相對標準偏差為0.34%～14.49%，平均值為8.14%，具有較好的重復性，并通過NIST08標準譜庫圖譜和保留指數定性，共鑒定出86種揮發性成分，結果如表1。

圖4 醬油樣品揮發性成分總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of volatile compounds of soy sauce sample

表1 醬油樣品揮發性成分HS-SPME-GC-MS分析結果

續表1

注：RIexp為測得的保留指數；RIlit為標準譜庫文獻和參考文獻[4, 7, 9, 16]中的保留指數；RSD為3個平行實驗揮發性成分絕對峰面積的相對標準偏差。

由表1可知，所分析醬油樣品的揮發性成分包括酯類、酸類、醛類、酮類、呋喃類、酚類、含硫類、碳氫類、含氮類和醇類等物質。酯類、醇類、醛類和酸類的含量較高，相對含量分別為36.35%、19.95%、14.61%和13.67%，而其他6類揮發性成分的含量均相對較低，為0.6%～4.32%。在樣品揮發性成分中，乙酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙醇、2-甲基丁醛、2-苯基丙烯醛、癸醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、苯乙醛、壬醛、苯甲酸、異辛酸、乙酸和4-乙基愈創木酚的相對含量均高于1%，為樣品中主要的揮發性成分。其他相關文獻報道中，乙酸乙酯、乙醇、苯甲酸、2-甲基丁醛、乙酸、苯乙醛和4-乙基愈創木酚等也被確認為醬油中主要的揮發性成分[3, 7, 11, 16]。

3 結論

不同型號SPME萃取頭對醬油揮發性成分的萃取靈敏度和重復性具有明顯差異，即萃取效果明顯不同，其中65μ mPDMS/DVB的萃取效果最好；并通過條件優化，確定其萃取條件為：樣品用量8 mL，萃取溫度60 ℃，萃取時間60 min。采用優化的HS-SPME方法對醬油樣品揮發性成分進行提取，經GC-MS分析，共鑒定出86種揮發性成分，且揮發性成分峰面積的平均相對標準偏差為8.14%，有較好的重復性。

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Optimizationofextractionconditionsforvolatilecompoundsinsoysaucebysolid-phasemicroextraction

LIU Fei, DU Li-ping*, XIAO Dong-guang

(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) was commonly used for the extraction of volatile compounds. To determine the SPME fiber to extract volatile compounds in soy sauce, the sensitivity of different fibers were examined on the basis of cumulative area normalization value, and their repeatability were examined by the average value and standard deviation of relative standard deviation(RSD) of peak area.65μm PDMS/DVB was then selected to extract volatile compounds in soy sauce. By comparing the peak area of all kinds of volatiles and the total peak area, the extraction conditions were optimized, and the extraction conditions were established as follows: the volume of soy sauce sample was 8 mL, extraction temperature was 60 °C and extraction time was 60 min. Using the optimized method for the extraction of volatile compounds in soy sauce, a total of 86 compounds were identified by GC-MS, wherein the main compounds were esters and followed by alcohols, aldehydes and acids. The average RSD of the peak area of compounds was 8.14%, which showed that the repeatability of the method was well.

headspace solid-phase microextraction; soy sauce; volatile compounds; sensitivity; repeatability; optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013834

碩士研究生(杜麗平副教授為通訊作者,E-mail:dlp123@tust.edu.cn)。

國家重點研發計劃項目(2016YFD0400505)

2017-01-18，改回日期：2017-05-03