新疆葡萄酒高產酸釀酒酵母菌的篩選和發酵條件優化

馬文瑞，魏玉潔，鄒彎，吳浩天，田歌，王德良，馬靜，高林龍，武運*，薛潔*

1(新疆農業大學，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)

新疆葡萄酒高產酸釀酒酵母菌的篩選和發酵條件優化

馬文瑞1，魏玉潔1，鄒彎1，吳浩天1，田歌1，王德良2，馬靜1，高林龍1，武運1*，薛潔2*

1(新疆農業大學，新疆 烏魯木齊，830052)2(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)

以從新疆阜康、昌吉、焉耆3個產區的葡萄和土壤中所篩選出的39株酵母菌為出發菌株，以便確定高產酸釀酒酵母篩選培養基配方及其靈敏性。通過初篩和復篩，獲得1株產酸含量高的釀酒酵母Y6，結果表明該菌株的揮發酸含量與商業酵母菌株71B基本一致，并對產酸酵母菌的發酵條件進行優化。單因素試驗確定了初始酸度、發酵溫度和酵母菌接種量對酵母菌產酸能力的影響較為顯著，選取這3個因素進行響應面優化，得到優化條件是：葡萄汁初始酸度為6.70 g/L、發酵溫度為20.35 ℃、接種量為109CFU/mL，響應預測值達1.7664 g/L。同時，最佳優化條件下獲得的實際值與預測值吻合，說明所建立的回歸模型是切實可行的。在小型葡萄酒發酵生產試驗中，與71B相比，釀酒酵母Y6產酸量提高了1.84 g/L。

釀酒酵母；高產酸；培養基靈敏性；單因素試驗；響應面優化

釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)是優質葡萄酒生產的關鍵之一[1-3]，其性能的優劣不僅對葡萄酒的口感和風味影響很大，而且還直接影響到所釀葡萄酒的產量、質量[4-8]。新疆是我國優質釀酒葡萄產地之一[9]，但是由于該地區日溫差大、降雨量少等氣候特點，造成了釀酒葡萄原料糖高酸低的特點。糖度過高，抑制酵母菌生長，酵母菌將葡萄糖轉化為酒精的能力下降；酸度過低則會使葡萄酒顏色黯淡無光，口感單調、不清新；所以糖高酸低直接影響到新疆地區葡萄酒的品質[10-13]。因此篩選具有新疆產區的釀酒酵母菌，提高葡萄酒的質量，是未來新疆葡萄酒工業發展的重點。

有關產區特色酵母菌的篩選，國內外研究報道很多，PEREZ-COELLO等從德國La Mancha的葡萄園中篩選出了3株酵母菌可以增加葡萄酒的果香味，提高其中的草藥香氣[14]；凌云等采用WL培養基對河北昌黎地區采集的赤霞珠進行初篩，獲得性能優良的酵母菌株CLY03和CLY04，并通過一系列耐受性試驗表明，這2菌株的香氣和典型性得分都高于對照菌株，其發酵的葡萄酒體現了產區的品質和特色[15]；商敬敏從山東蓬萊和云南德欽的葡萄園土壤中分離出的酵母菌，其中有5株菌發酵的酒樣中乳酸乙酯含量明顯高于其他酒樣，果香味優雅濃郁[16]。但目前有關高產酸天然酵母菌的篩選、發酵條件的優化和改善葡萄酒風味的研究較少。

本研究以篩選出的新疆葡萄酒高產酸酵母菌為研究對象，通過單因素試驗和響應面法優化發酵條件，確定該菌株最佳產酸的發酵條件，為該菌株在生產應用中提供一定的理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1 原料與化學試劑

葡萄酵母篩選原料和釀酒葡萄原料：新疆阜康、昌吉和焉耆3個地區的赤霞珠葡萄及葡萄根部土壤；商業酵母71B：市場購買法國進口酵母。

麥芽汁培養基，PDA培養基，YPD培養基，去離子水，溴甲酚綠，菲林試劑A、B液，0.5%葡萄糖標液，4.0%HCl溶液，4.0 mol/L NaOH溶液，1.0%次甲基藍，1.0%酚酞，0.05 mol/L NaOH溶液等。

1.1.2 儀器與設備

DHZ-B全溫振蕩器，太倉市豪威實驗儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；離子色譜儀，美國賽默飛世爾科技，戴安ICS3000；電子天平，梅特勒-托利多實驗室；LRH-250生化培養箱，上海恒科儀器有限公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；PHS-3C雷磁pH計等。

1.2實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離純化與鑒定

1.2.1.1 酵母菌的分離純化

具體方法參照魏玉潔等人的《新疆地產葡萄酒優良釀酒酵母菌的篩選》[17]。

1.2.2 高產酸釀酒酵母菌篩選培養基配方的確定及靈敏性驗證

1.2.1.1 高產酸釀酒酵母菌篩選培養基的確定

以12 °P麥汁、PDA、YPD為基礎培養基，添加0.01%、0.02%和0.10%的溴甲酚綠，調pH為最適pH=6.0，115 ℃滅菌20 min，接菌，最適培養基確定為易于觀察菌落周圍所出現的黃色圈并且加入溴甲酚綠后的培養基最為接近pH=6.0[18]。

1.2.1.2 培養基靈敏性驗證

配制濃度分別為4.00、4.50、5.00、5.50、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00、8.50 g/L的酒石酸溶液，滴加1滴到培養基中，觀察0 h 和2 h后黃色圈的直徑大小判定酒石酸溶液濃度差異在0.50 g/L范圍內的靈敏性，使用游標卡尺測量黃色圈直徑，減去牛津杯的內直徑，即為黃色圈實際的直徑。

1.2.3 高產酸釀酒酵母菌初篩

1.2.3.1 培養基初篩釀酒酵母菌

活化篩選所得釀酒酵母菌，挑取1環接種于培養基上，28 ℃靜置培養24 h，觀察黃色圈，選擇菌落周圍出現較大黃色圈的菌株進行發酵試驗。

1.2.3.2 發酵初篩

調節葡萄汁總糖含量為210 g/L，用500 mL三角瓶分裝葡萄汁，每瓶200 mL，115 ℃滅菌20 min，葡萄汁冷卻后接入106CFU/mL菌懸液，25 ℃發酵，每天稱重，觀察發酵情況，直至發酵結束測定其總糖、總酸和揮發酸含量，具體方法參照GB15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]，每株菌測定指標各做3組平行試驗，取平均值。

1.2.4 高產酸釀酒酵母菌復篩

1.2.4.1 培養基復篩釀酒酵母菌

稱取0.06 g商業酵母71B加入10 mL 2%的葡萄糖水中，28 ℃振蕩活化30 min。將初篩所得菌株和71B分別配置為106CFU/mL菌懸液，先在培養皿中倒入一層剛好可以覆蓋培養皿底部的溴甲酚綠培養基，待其凝固后放入牛津杯，再倒入一層溴甲酚綠培養基，凝固后取出牛津杯，接種0.1 mL菌懸液于牛津杯孔洞內，28 ℃靜置培養24 h，觀察黃色圈，選擇黃色圈大于71B的菌株進行發酵試驗。

1.2.4.2 發酵復篩

方法同1.2.3.2，以71B為對照試驗，發酵結束后，選擇產酸量最大的菌株。

1.2.5 影響釀酒酵母菌產酸能力的單因素試驗

葡萄汁初始酸度、初始糖濃度、發酵溫度、接種量作為影響釀酒酵母菌產酸能力的主要因素，通過單因素試驗選取響應面試驗的因素和水平。單因素試驗使用篩選所得高產酸酵母菌。

1.2.5.1 葡萄汁初始酸度對酵母菌產酸能力的影響

調節葡萄汁初始總糖含量為210 g/L，葡萄酒初始總酸為4.5 g/L，用酒石酸調節總酸含量分別為5.00、5.50、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00 g/L，發酵工藝和總酸測定方法同1.2.3.2。

1.2.5.2 葡萄汁初始糖濃度對酵母菌產酸能力的影響

以初始酸含量為4.5 g/L的葡萄汁為原料，調節總糖含量分別為150、180、210、240、270 g/L，發酵工藝和總酸測定方法同1.2.3.2。

1.2.5.3 發酵溫度對酵母菌產酸能力的影響

調節葡萄汁總糖為210 g/L，初始酸含量為4.5 g/L，分別放置在15、18、21、24、27 ℃培養箱中進行發酵，發酵工藝和總酸測定方法同1.2.3.2。

1.2.5.4 接種量對酵母菌產酸能力的影響

調節葡萄汁總糖為210 g/L，初始酸含量為4.5 g/L，滅菌冷卻后分別接入104、105、106、107、108CFU/mL菌懸液，發酵工藝和總酸測定方法同1.2.3.2。

1.2.6 釀酒酵母菌產酸能力響應面優化試驗

根據Box-Behnken設計原理設計3因素3水平響應面試驗，見表1。

表1 響應面Box-Behnken試驗因素編碼及水平

1.2.7 小型生產中高產酸酵母菌的有機酸含量及成分的測定

總酸和揮發酸含量等理化指標的測定方法同1.2.3.2，有機酸含量及成分的測定參照楊東偉等人的《高效液相色譜法測定葡萄酒中11種有機酸含量》[20]。

2 結果與分析

2.1酵母菌分離結果與分析

通過分離純化，確定了39株酵母菌，將其重新統一編號為Y1～Y39，菌落形態如圖1所示。

圖1 部分酵母菌菌落形態Fig. 1 Colony form of some yeasts

2.2高產酸釀酒酵母菌篩選培養基配方的確定及靈敏性驗證結果與分析

2.2.1 高產酸釀酒酵母菌篩選培養基的確定

通過試驗證明，當12 °P麥汁基礎培養基加入溴甲酚綠后，凝固性較差，接菌存在一定的困難；以YPD為基礎培養基時，由于培養基本身顏色較深，加上溴甲酚綠的影響，不便于觀察菌落周圍所出現的黃色圈大小；相比之下，PDA本身顏色較淺，且凝固型良好，可作為該試驗的基礎培養基。當溴甲酚綠添加量為0.10%時，其本身的顏色會影響試驗結果的觀察，且培養基pH大大增加，需要添加NaOH中和；當添加量為0.02%時，pH還是略微偏高，而當添加量為0.01%時，不采用任何手段就可以達到培養基的最適pH，所以，將PDA基礎培養基+0.01%溴甲酚綠作為篩選高產酸釀酒酵母菌的培養基。

2.2.2 產酸培養基靈敏性驗證

將酒石酸濃度靈敏范圍控制在0.50 g/L內，不同酒石酸濃度所產生的黃色圈大小如表2所示。

表2 不同酒石酸濃度所產生的黃色圈大小

由表2和圖2看出，隨著酒石酸濃度的增大，所產生的黃色圈直徑整體呈增大趨勢，而從4.50 g/L到6.5 g/L的酒石酸濃度范圍內，黃色圈的直徑變化十分微弱，都在0.10 mm以內，肉眼基本無法區分，靈敏性較差；從6.50～8.50 g/L的酒石酸濃度范圍中，黃色圈直徑變化都超過了0.10 mm，肉眼較易觀察，靈敏性顯著，證明該培養基適用于高產酸酵母菌的篩選。

圖2 0 h和2 h后不同酒石酸濃度的黃色圈Fig.2 The yellow circle of tartaric acid concentration at zero hour and two hours

2.3高產酸釀酒酵母菌的初篩結果與分析

酵母菌的初篩包括培養基初篩和發酵試驗初篩，在培養基初篩中， 39株釀酒酵母菌培養24 h后，最終選出菌落周圍產生黃色圈較大的8株酵母菌，分別為：Y1、Y3、Y6、Y8、Y24、Y30、Y33和Y34。

對該8株釀酒酵母菌進行發酵初篩試驗，發酵結束后檢測其發酵液理化指標，表3數據顯示各處理樣品符合GB15037—2006《葡萄酒》[21]；其中Y1、Y3、Y6和Y24具有良好的平行性，發酵穩定，其發酵液總酸含量為8.00 g/L左右，發酵后總酸含量增長了約2.00 g/L，比對照菌株產酸量高約1.50 g/L左右，其余菌株產酸量較其他四株相比較低或者發酵平行性較差。綜上所述，用Y1、Y3、Y6和Y24進行復篩。

表3 8株釀酒酵母菌發酵液理化指標

注：葡萄原汁總糖含量為191.99 g/L；總酸含量為6.029 g/L。

2.4高產酸釀酒酵母菌的復篩結果與分析

初篩的4株酵母菌在培養基復篩中，牛津杯孔洞周圍所產生的黃色圈大于71B的3株酵母菌，分別為：Y1、Y6和Y24，見圖3。

圖3 復篩圖片Fig.3 Secondary screening pictures

對Y1、Y6和Y24以71B為對照進行發酵復篩試驗，發酵結束后檢測其發酵液理化指標，表4數據顯示各處理樣品符合GB15037—2006《葡萄酒》[21]；Y1、Y6、Y24和71B都具有良好的平行性；發酵后71B發酵液總酸含量為6.81 g/L，Y1和Y24約為7.00 g/L，Y6為8.65 g/L，Y6產酸量高于Y1和Y24且明顯高于71B，同時，Y6的揮發酸含量與71B基本一致，綜上所述，得到了1株高產酸優良釀酒酵母菌Y6。

表4 四株釀酒酵母菌發酵液理化指標

注：葡萄原汁總糖含量為210g/L，總酸含量為6.25g/L。

2.5影響釀酒酵母菌產酸能力因素的結果與分析

2.5.1 葡萄汁初始酸度的影響

由圖4可知，葡萄汁初始酸度對酵母菌產酸量的影響較為顯著(P<0.05)，隨著葡萄汁初始酸度的增大，酵母菌產酸量呈先增高后降低趨勢，當初始酸度為6.50 g/L時，酵母菌產酸量達到最大值為 1.79 g/L。因此，酵母菌產酸能力的最佳初始酸度為6.50 g/L。

圖4 不同初始酸度對酵母菌產酸量的影響Fig.4 Effect of initial acidity on the acid production capacity of yeast

2.5.2 葡萄汁初始糖度的影響

由圖5顯示，當葡萄汁初始糖濃度為210 g/L，酵母菌產酸量達到最大值為2.02 g/L，但是方差分析得初始糖濃度對酵母菌產酸量的影響不顯著(P>0.05)，當糖濃度從150 g/L增加到180 g/L時，其產酸量明顯增大，而從180 g/L增加到210 g/L時，產酸量的上升率變化不大，前者產酸量明顯增大是因為150 g/L的糖濃度達不到酵母菌發酵所消耗糖含量，所以其活性降低導致產酸量低，而糖濃度為180 g/L時，基本滿足酵母菌的發酵，所以活性較好，產酸量上升；當糖濃度高于240 g/L時，酵母菌的活性反而受到了抑制，導致產酸量下降。

圖5 不同初始糖濃度對酵母菌產酸量的影響Fig.5 Effect of sugar concentration on the acid production capacity of yeast

2.5.3 葡萄酒酒精發酵溫度的影響

由圖6可知，發酵溫度對酵母菌產酸量的影響較為顯著(P<0.05)。隨著發酵溫度的增大，酵母菌產酸量呈現先增高后降低的趨勢，當發酵溫度為21 ℃時，產酸量最高，因此，酵母菌產酸能力最好的發酵溫度為21 ℃。

圖6 不同發酵溫度對酵母菌產酸量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on the acid production capacity of yeast

2.5.4 酵母菌接種量的影響

由圖7看到，發酵溫度對酵母菌產酸量的影響有顯著差異(P<0.05)。隨酵母菌接種量的增大，酵母菌產酸量呈直線上升趨勢，當酵母菌接種量為108CFU/mL時，產酸量最高，因此，酵母菌產酸能力最好的接種量為108CFU/mL。

圖7 不同酵母菌接種量對酵母菌產酸量的影響Fig.7 Effect of inoculum amount on the acid production capacity of yeast

2.6釀酒酵母菌產酸能力響應面優化試驗結果與分析

根據單因素試驗結果，采用響應面法對影響釀酒酵母菌產酸能力的初始酸濃度(A)、發酵溫度(B)和接種量(C)3個因素和水平進行數據編碼處理，采用3因素3水平響應面優化試驗，結果如表5所示。

表5 Box-Behnken試驗設計與結果

注：自變量C中1.5表示接種量為107CFU/mL；2.0表示接種量為108CFU/mL；2.5表示接種量為109CFU/mL。

通過分析因素間交互作用的影響，結果下圖所示。從圖中結果可以看出初始酸度和接種量交互作用對酵母菌產酸能力影響最為顯著，初始酸度和發酵溫度交互作用對酵母菌產酸能力影響較顯著。如圖8所示，當發酵溫度恒定時，初始酸度在6.70 g/L時產酸量最大，圖9得，當接種量一定時，酵母菌產酸量隨初始酸度的增長而較小，6.55 g/L時又逐漸增多，因此初始酸度選擇6.70 g/L左右最好；由圖9可以看出，隨著接種量和初始酸度的增長，酵母菌產酸能力逐漸增大，當接種量達108CFU/mL、初始酸度達6.60 g/L時產酸量明顯增大。

圖8 初始酸度和發酵溫度的交互作用對酵母菌產酸能力的影響Fig.8 Effect of initial acidity and fermentation temperature (AB) on the acid production capacity of yeast

圖9 初始酸度和接種量的交互作用對酵母菌產酸能力的影響Fig.9 Effects of initial acidity and inoculum amount (AC) on the acid production capacity of yeast

通過響應面優化，預測到最佳產酸發酵條件為：初始酸度6.70 g/L，發酵溫度20.35 ℃，接種量109CFU/mL，響應預測值為1.766 4 g/L。按照響應面優化推薦的最優條件進行試驗論證，酵母菌實際平均產酸能力為1.69 g/L，與預測值擬合率達95.67%，表明預測值和實際值有良好的擬合性，優化模型可靠。

2.7小型生產中高產酸酵母菌的有機酸含量及成分的結果與分析

在2個2.5 L廣口瓶里分別裝2 L赤霞珠葡萄汁(理化指標為：還原糖263.1 g/L；總酸5.25 g/L； pH 為4.80；添加總SO2約60 mg/L)，分別加入高產酸酵母和商業釀酒酵母，使終濃度達到1×109CFU/mL，按照GB15037—2006《葡萄酒》進行生產[21]，發酵溫度25 ℃。發酵結束后取澄清的干紅葡萄酒，取樣測定有機酸含量，結果如表6、表7所示。

表6 兩株酵母菌生產葡萄酒的理化指標

表7 兩株酵母菌株生產葡萄酒主要有機酸的組成

所篩菌株與商業釀酒酵母相比，發酵結束后殘糖均小于4 g/L，酒精度無顯著差異，因此篩選的菌株符合工業發酵的要求；同時篩選菌株的有機酸含量明顯高于商業釀酒酵母，該菌株所產生的有機酸，主要是酒石酸和蘋果酸，而對揮發酸的影響較小，可以滿足葡萄酒生產的要求。

3 結論

(1)確定了高產酸釀酒酵母菌的篩選培養基配方為：PDA培養基+0.01%溴甲酚綠，調pH為6.0，115 ℃滅菌20 min，且培養基靈敏性良好。

(2)通過對新疆3個釀酒葡萄產區的葡萄和土壤已篩選出的39株酵母菌進行2次培養基和發酵試驗篩選得出一株高產酸釀酒酵母菌Y6，該菌株的產酸量比71B高出27%。

(3)酵母菌產酸能力的最佳單因素水平為：初始酸度為6.50 g/L，發酵溫度為21 ℃，接種量為 108CFU/mL；通過響應面優化試驗預測的最佳產酸發酵條件試驗論證得出，初始酸度6.70 g/L，發酵溫度20.35 ℃，接種量109CFU/mL，響應預測產酸量為1.7664 g/L，實際平均產酸能力為1.69 g/L，與預測值擬合率達95.67%。

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Screeningofhigh-yieldingacidyeaststrainsinXinjiangwineproducingregionsandoptimizationoffermentationconditions

MA Wen-rui1,WEI Yu-jie1,ZOU Wan1,WU Hao-tian1,TIAN Ge1, WANG De-liang2,MA Jing1, GAO Lin-long1, WU Yun1*,XUE Jie2*

1(Department of Food science and Pharmacy, Xinjiang Agriculture University, Urumqi 830052, China) 2(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 10015, China)

39 yeast strains from three major wine-producing regions in Xinjiang including Changji, Manasi and Fukang were screened out to determine culture medium formulation and sensitivity of organic acids high-yieldingSaccharomycescerevisiae. Through initial and repeated screening, 1 strain ofSaccharomycescerevisiaewith high-yielding acids named as Y6 was screend out. The results showed that the volatile acid content ofSaccharomycescerevisiaeY6 was the same as that of commercial yeast strain 71B. Based on these single factor tests, response surface methodology with three variables was employed to optimize the fermentation conditions such as initial acidity, fermentation temperature and inoculum amount. Results showed the optimal fermentation conditions were grape juice initial acidity of 6.70 g/L, fermentation temperature of 20.35 ℃ and inoculum amount of 109CFU/mL. Under these optimal conditions, the acid production capacity reached 1.766 4 g/L. Finally, the consistent results between the predicted value and actual value indicated that the established model in this study was feasible. In a small scale of wine fermentation experiment, compared with the commercial strain 71B, the acid production of Y6 was increased by 1.84 g/L.

Saccharomycescerevisiae; high-yielding acid; culture medium sensitivity; single factor test; response surface

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014187

碩士研究生(武運教授、薛潔教授級高級工程師為通訊作者,E-mail:764630324@qq.com；825728388@qq.com)。

新疆維吾爾自治區重大科技專項(項目編號：2017A01001-2)；國家自然科學基金項目—地區科學基金項目(項目編號：31360406)

2017-03-01，改回日期：2017-04-25