TRPV4對腦血管平滑肌增殖及凋亡的影響

馮 輝， 臧 莉， 趙振霞

TRPV4對腦血管平滑肌增殖及凋亡的影響

馮 輝， 臧 莉， 趙振霞

目的 探究新型鈣離子通道香草醛受體4(transient receptor potential vanilloid receptor,TRPV4)對自發性高血壓(spontaneously hypertensive rats，SHR)大鼠腦血管平滑肌增殖及凋亡的影響。方法 分離并培養大鼠腦基底動脈平滑肌細胞(basilar arterial smooth muscle cells,BASMCs)，采用實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)及免疫印跡(Western blot)法檢測細胞中TRPV4的表達。轉染TRPV4 siRNA沉默TRPV4基因，CCK-8檢測細胞增殖、流式細胞術檢測細胞周期及凋亡;Western blot檢測cyclinD1、p-Rb、Bcl-2、cleaved-caspase-3/caspase-3、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β蛋白表達。結果 qRT-PCR及Western blot結果顯示自發性高血壓大鼠BASMCs中TRPV4的表達明顯高于對照組大鼠。而在自發性高血壓大鼠BASMCs中，沉默TRPV4可抑制細胞增殖，阻滯細胞周期并誘導其凋亡；此外還可下調cyclinD1、p-Rb、Bcl-2、p-AKT、p-GSK3β蛋白的表達，同時上調cleaved-caspase-3蛋白的表達。 結論 沉默TRPV4能夠抑制自發性高血壓大鼠BASMCs細胞增殖，同時促進細胞凋亡，機制可能與抑制AKT/GSK3β信號通路的激活有關，所以新型鈣離子通道TRPV4可為今后靶向診療高血壓腦血管疾病提供依據。

TRPV4； 腦血管平滑肌細胞； 細胞增殖及凋亡； AKT/GSK3β信號通路

以腦卒中為主的腦血管疾病成為威脅人們的健康主要殺手之一，而高血壓則被認為是引起腦卒中的關鍵性獨立危險因素[1,2]。卒中過程中多伴有明顯的基底動脈和大腦中動脈重構，研究顯示血管重構與血管平滑肌細胞的異常增殖及凋亡、炎癥反應、纖維化等密切相關，但其具體機制尚不明確[3～5]。

近年來發現許多離子通道與高血壓腦血管重構密切相關，其中瞬時性受體電位通道(transient receptor potential,TRP)超家族即為其中之一[6,7]，TRPV4是其中香草醛受體(transient receptor potential vanilloid receptor,TRPV)亞族的成員之一，廣泛分布于神經系統、肝臟、腎臟、心臟等多種組織，激活時可促進鈣離子內流，鈣離子是調節平滑肌收縮的主要物質，并參與調控細胞的增殖、遷移等病理生理過程[8,9]。但TRPV4在腦血管平滑肌中的作用還并不明確。本研究首先檢測了TRPV4蛋白在腦血管平滑肌細胞中表達，初步分析其表達與高血壓的聯系。通過siRNA沉默TRPV4進一步分析其對腦血管平滑肌細胞的作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 胎牛血清(FBS)，F12培養基及Opti-NEM培養基均購自美國Gibco公司；LipofectAMINE2000及相關轉染試劑購自Invitrogen；小鼠抗大鼠平滑肌α-actin單克隆抗體及FITC熒光二抗均購自武漢博士德公司；TRPV4、cyclinD1、p-Rb、Bcl-2、cleaved-caspase-3/caspase-3、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β抗體均購自英國Abcam公司；CCK-8細胞增殖分析試劑盒購自日本同仁化學研究所；細胞周期及凋亡檢測試劑盒購自南京凱基科技發展有限公司；TRPV4 siRNA及其陰性對照質粒由美國Dharmacon公司提供；SYBR Green I real-time PCR kit由上海吉瑪制藥技術有限公司提供；其余試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞分離、鑒定及培養 水合氯醛麻醉6只自發性高血壓(spontaneously hypertensive rats，SHR)大鼠(18 w齡、SPF級、200～220 g)和6只正常血壓(Wistar-Kyoto rats，WKY)大鼠(18 w齡、SPF級、200～220 g)后，斷頭處死，開顱并迅速取出腦基底動脈。將其轉移至冰Krebs液中小心分離血管周圍的結締組織和分支并漂洗兩次，再次轉移至含20%FBS的F12培養基中，用剪刀將血管反復剪碎后，轉入培養瓶中，常規培養于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中。3～4 d可見細胞爬出并半數換液，7 d之后正常傳代，通常第8～12代細胞用于實驗。鑒定：取第二代細胞接種于Confocal專用小皿中，貼壁后去除培養基并用PBS漂洗3×5 min。4%多聚甲醛固定后加0.1% Triton 100 μl穿孔3～5 min，加PBS漂洗后，用5%BSA封閉細胞30 min。加α-actin一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜。PBS漂洗3×10 min。加FITC熒光二抗(1∶2000)室溫下避光孵育細胞60 min， PBS漂洗3×10 min。用Confocal顯微鏡觀察并拍照。僅孵育熒光二抗的細胞作為陰性對照。

1.2.2 TRPV4 siRNA轉染和分組 取對數生長期細胞接種于6孔板中，待細胞融合至60%～80%，換無血清的培養基同步化12 h，隨后進行轉染。組別設為空白對照組(Ctrl)、陰性對照組(Negative siRNA，Neg)、轉染組(TRPV4 siRNA，siRNA)，每組6孔。將TRPV4 siRNA和Negative siRNA分別溶解于Opti-MEM培養基中孵育5 min，同時另取LipofectAMINE2000加入Opti-MEM培養基中室溫孵育5 min，將兩者輕柔混合，室溫孵育20 min。然后將混合物加入各組細胞中，于培養箱中培養6 h后，更換為正常完全培養基繼續培養48 h。提取細胞蛋白測定轉染效率并用于后續實驗分析。

1.2.3 CCK-8法測定細胞活力 取對數生長期細胞以2×103/孔的密度接種于96孔板中，經相應處理后繼續培養22 h，隨后向每孔中加入10 μl 的CCK-8試劑，置于培養箱中繼續培養2 h。用酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度值(OD)。每組設置3個復孔取均值，另設單孔只加入培養基作空白對照。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期 用不含EDTA的胰酶消化、離心收集各組細胞，PBS漂洗后離心并重懸細胞，用70%冰乙醇于4 ℃下避光固定過夜。離心洗去乙醇，避光的條件下加入碘化丙啶(PI)染色液，37 ℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測Ex=488 nm處的熒光強度。

1.2.5 Annexin V/PI 雙染色法檢測細胞凋亡 消化、離心收集各組細胞，PBS漂洗后離心并加Binding Buffer重懸細胞，先后加入Annexin V-FITC室溫避光孵育10 min及PI 避光反應5 min。流式細胞儀檢測Ex=488 nm及Em=530 nm處的熒光強度。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達水平 RIPA裂解、提取各組細胞蛋白， BCA蛋白定量試劑盒定量后調整各組蛋白上樣總量至60 μg，同時加入4倍體積的loading buffer進行SDS-PAGE電泳。然后通過電轉將蛋白轉移至PVDF膜上，加5%脫脂牛奶室溫條件下封閉90 min，依據說明書要求加入一抗TRPV4、cyclinD1、Bcl-2、caspase-3、AKT、GSK3β(1∶2000)和cleaved-caspase-3、p-Rb、p-AKT、p-GSK3β(1∶1000)4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌3×5 min。加入相對應的二抗(1∶2000)室溫條件下孵育90 min，TBST洗滌3×10 min，暗室中加ECL發光液顯影，定影并沖洗膠片，而后用Image J進行灰度分析。

1.2.7 qRT-PCR檢測mRNA表達水平 依據說明書加Trizol提取總RNA，純化后用全波段酶標儀測定所提RNA樣品的OD280值并進行核酸定量。取2 μg總RNA在逆轉錄酶的作用下逆轉錄至終體積為20 μl，而后采用SYBR Green I real-time PCR的方法檢測mRNA的相對表達。引物設計如下，TRPV4正向引物：5’-CCTTTGCTGCCTGTGTGAAC-3’；反向引物5’-GCTGGAGGATGAGGATGTGT-3’。 GAPDH作為內參，正向引物：5’-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3’；反向引物：5’-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGT-3’。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，然后進行40個循環(95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s)。采用2-△△CT法分析mRNA的相對表達量。

2 結 果

2.1 TRPV4的表達 顯微鏡下可見組織塊邊緣爬出的細胞呈梭形，細胞融合后呈典型的“谷”、“峰”狀生長。使用平滑肌細胞特異的α-actin免疫熒光染色鑒定細胞，可在Confocal鏡下觀察到95%以上的細胞胞漿呈綠色絲狀、條狀熒光(見圖1A、B)。證明培養的細胞是大鼠腦基底動脈的平滑肌細胞。qRT-PCR及Western blot結果顯示(見圖1C、D)自發性高血壓大鼠BASMCs中TRPV4的表達明顯高于對照組大鼠。

2.2 沉默TRPV4抑制細胞增殖 通過轉染TRPV4 siRNA沉默SHR大鼠BASMCs中TRPV4的表達，采用Western blot檢測轉染效率。結果顯示(見圖2A)，轉染了TRPV4 siRNA可顯著降低細胞中TRPV4的表達水平(P<0.05)。CCK-8檢測TRPV4沉默后的細胞活力，結果顯示(見圖2B)，沉默TRPV4后，細胞活力顯著低于陰性對照組(P<0.05)。進一步采用流式細胞術檢測細胞的周期分布，結果所示(見圖2C)，沉默TRPV4后，G0/G1期的細胞所占百分比增加至86.52%±4.86%(P<0.05)，S期細胞所占百分比減少至8.39%±1.31%，說明沉默TRPV4可抑制SHR大鼠BASMCs周期由G0/G1期向S期轉化。此外我們還檢測了細胞周期相關蛋白的表達情況，結果顯示(見圖2D)，沉默TRPV4后，cyclinD1及p-Rb的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。

2.3 沉默TRPV4促進細胞凋亡 采用流式細胞術AnnexinV/PI 雙染法檢測細胞的凋亡情況。結果顯示(見圖3A)，沉默TRPV4后，早期凋亡率由14.57%±1.82%增加至37.78%±2.21%(P<0.05)。而中晚期細胞凋亡/細胞壞死率則由6.42%±1.19%增加至14.32%±1.23%。結果表明，沉默TRPV4可促進SHR大鼠BASMCs的凋亡。此外我們還檢測了細胞凋亡相關蛋白的表達情況，結果顯示(見圖3B)，沉默TRPV4后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著降低，而效應蛋白cleaved-caspase-3的表達則明顯增加。

2.4 沉默TRPV4對AKT/GSK3β信號通路的影響 為進一步探討沉默TRPV4抑制細胞增殖，并促進凋亡的可能作用機制，我們通過Western blot檢測了增殖及凋亡相關信號通路AKT/GSK3β的表達情況。結果顯示所示(見圖4)，沉默TRPV4后AKT及GSK3β蛋白的磷酸化水平均顯著降低(P<0.05)，提示沉默TRPV4可抑制AKT/GSK3β信號通路的活性。

圖1 TRPV4的表達

圖2 沉默TRPV4對細胞活力及周期的影響

圖3 沉默TRPV4對細胞凋亡的影響

3 討 論

TRPV4是瞬時性受體電位通道超家族的一員，廣泛表達于多種哺乳動物組織中，包括鈣離子調控、炎癥反應、纖維化及腫瘤等[10～12]。既往研究表明[13,14]，TRPV4可表達于大鼠肺動脈平滑肌細胞，促進細胞遷移，并參與肺動脈重構。但探討TRPV4與高血壓及腦血管重構之間關系的研究較少，本研究檢測了SHR大鼠腦基底動脈平滑肌細胞上TRPV4的表達情況。結果顯示，相比于對照組，SHR大鼠BASMCs中TRPV4的表達明顯升高。結果提示TRPV4可能參與調控自發性高血壓大鼠腦基底動脈平滑肌細胞的生理功能。

本研究通過TRPV4 siRNA干擾SHR大鼠BASMCs中TRPV4的表達，以研究其具體功能。結果顯示，沉默TRPV4可明顯抑制SHR大鼠BASMCs細胞活力并抑制細胞周期由G0/G1期向S期轉化，提示沉默TRPV4可抑制SHR大鼠BASMCs細胞增殖。細胞周期的G1/S轉換主要受到D型周期素(cyclinD)的調控，cyclinD可通過與CDK結合形成復合物，促進Rb的磷酸化，促使細胞進入S期DNA復制[15,16]。故而我們檢測了細胞中細胞周期相關蛋白cyclinD1及p-Rb的表達，結果顯示沉默TRPV4后，細胞中cyclinD1及磷酸化視網膜母細胞瘤(phosphorylation retinoblastoma,p-Rb)的蛋白表達水平顯著降低。說明TRPV4可通過細胞周期相關因子來調控細胞周期。進一步采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果還顯示沉默TRPV4可促進SHR大鼠BASMCs的凋亡，且抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著降低，而效應蛋白cleaved-caspase-3的表達則明顯增加。

離子通道對于細胞增殖及凋亡的影響通常是通過相關的信號通路來發揮作用的，如：有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、MAPK系統激活因子(MAPKKK,Raf)/細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、磷脂酰肌醇(-3)激酶、磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI-3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)等在細胞周期及細胞凋亡的調節中發揮重要作用[17～19]。本研究發現，沉默TRPV4后AKT及GSK3β蛋白的磷酸化水平均顯著降低，提示沉默TRPV4可抑制AKT/GSK3β信號通路的活性。因此推測新型鈣離子通道TRPV4可能通過AKT/GSK3β通路調控細胞的增殖及凋亡，但具體機制仍需進一步深入研究。

綜上所述，沉默TRPV4能夠抑制自發性高血壓大鼠BASMCs細胞增殖，同時促進細胞凋亡，機制可能與抑制AKT/GSK3β信號通路的激活有關，所以新型鈣離子通道TRPV4可為今后靶向診療高血壓腦血管疾病提供依據。

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Effect of TRPV4 on the proliferation and apoptosis of basilar arterial smooth muscle cells

FENG Hui，ZANG Li，ZHAO Zhen-xia.

(No.5 Department of Neurology,First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Xinxiang 453100,China)

Objective To study the expression and effect of a novel calcium channel TRPV4 on the proliferation and apoptosis of BASMCs in spontaneous hypertension rat(SHR).Methods The expression of TRPV4 in BASMCs was checked by qRT-PCR and Western blot assay.TRPV4 siRNA was used to block TRPV4 channel in BASMCs.Cell survival was determined by the CCK-8 assay,while cell cycle and apoptosis was detected by flow cytometry.The expressions of cyclinD1,p-Rb,bcl-2,cleaved-caspase-3/caspase-3,p-AKT/AKT,p-GSK3β/GSK3β proteins were detected by Western blot.Results qRT-PCR and Western blot showed that the expression of TRPV4 was markedly increased in BASMCs of SHR compared to (WKY).Cell viability decreased after transfected with TRPV4 shRNA in BASMCs of SHR,while cell cycle arrest and apoptosis were induced.Furthermore,the expression of cyclinD1,p-Rb,Bcl-2,p-AKT,p-GSK3β protein were down-regulated and the expression of cleaved-caspase-3 protein was up-regulated.Conclusion Block of TRPV4 in BASMCs of SHR could inhibit cell proliferation andpromote cell apoptosis.The mechanism may be related to the inhibition of AKT/GSK3 β pathway.So the new calcium ion channel TRPV4 provided a new target for diagnosis and therapy of hypertensive encephalopathy.

TRPV4; Basilar arterial smooth muscle cells; Cell proliferation and apoptosis; AKT/GSK3β pathway

2017-04-12；

2017-05-30

河南衛計委項目(201602154)資助

(新鄉醫學院第一附屬醫院神經內五科，河南 新鄉 453100)

馮 輝，E-mail：xyfenghui@126.com

1003-2754(2017)08-0721-04

R773.3

A