干擾素α對乙型肝炎病毒感染小鼠血清病毒標記物的影響*

周 云，李 盛，唐宗生，楊東亮，宋景嬌

·短篇論著·

干擾素α對乙型肝炎病毒感染小鼠血清病毒標記物的影響*

周 云，李 盛，唐宗生，楊東亮，宋景嬌

目的 探討干擾素-α（IFN-α）在高壓尾靜脈注射乙型肝炎病毒（HBV）感染小鼠血清HBV標記物的影響。方法 采用高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2和pCMV2/IFN-α4表達質粒，建立HBV感染小鼠模型，采用ELISA法檢測血清HBsAg、HBeAg、HBsAb和HBcAb。分離小鼠肝臟內淋巴細胞，使用流式細胞儀檢測淋巴細胞FoxP3表達情況。結果 在高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2質粒后第1 d，小鼠血清HBsAg和HBeAg開始出現陽性，而第20 d時HBsAg和HBeAg已消失；在注射pAAV/HBV 1.2+IFNα 后第 1 d，血清 HBeAg水平為（0.55±0.16），顯著低于 pAAV/HBV 1.2 組【（1.40±0.13），P＜0.05）；在注射后第 10 d，血清 HBsAg水平為（0.35±0.20），顯著低于 pAAV/HBV 1.2 組【(2.35±0.15），P＜0.05】；在高壓尾靜脈注射后 20 d，兩組小鼠血清HBsAb陰性；在注射pAAV/HBV1.2后第10 d和20 d，兩組小鼠血清HBcAb陽性水平差異無統計學意義（P＞0.05）；注射后，兩組小鼠肝內CD4+T淋巴細胞FoxP3表達未見顯著變化。結論 IFN-α具有抗HBV作用，并未誘導免疫負調控反應。

乙型肝炎；pCMV2/IFN-α4表達質粒；HBsAg；HBeAg；小鼠

全世界約有20億人感染過HBV，其中3.5億為慢性HBV攜帶者，每年死于肝炎、肝硬化和肝癌患者約60萬[1]。干擾素α（Interferon-alpha，IFN-α）是目前治療慢性乙型肝炎的主要藥物之一，具有廣譜抗病毒和免疫調節作用，抑制病毒復制，促進人類白細胞抗原表達，增強NK和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）活性[2，3]。我們在高壓尾靜脈注射HBV感染小鼠探討了IFN-α的抗病毒和免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 SPF級BALB/c雌性小鼠，8周齡，購自湖北省疾病控制中心，飼養于我院實驗動物中心。所有動物實驗均符合本校動物實驗倫理委員會的規定。pAAV/HBV1.2和pCMV2/IFN-α4分別由臺灣大學陳培哲教授和德國伊斯堡-埃森大學病毒研究所陸蒙吉教授惠贈。檢測HBV標記物的ELISA試劑盒購自上海科華生物工程股份有限公司；Endo-free Plasmid Maxi Kit購自美國OMEGA公司；APC標記的抗鼠CD4、PE標記的抗小鼠/大鼠FoxP3抗體和FoxP3穿孔/固定濃縮稀釋液購自美國ebioscience公司。膠原酶II和Percoll淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司。

1.2 HBV感染小鼠模型的建立 將pAAV/HBV1.2 10μg或pCMV2/IFN-α4質粒20μg單獨或共同溶解于相當于小鼠體質量10%的生理鹽水，混勻后轉移至注射器，自小鼠尾靜脈末端1/3處迅速注入。注射后第1 d、10 d、20 d采血，分離血清，標本凍存于-80℃冰箱。

1.3 血清HBV標記物的檢測 將小鼠血清與1×PBS按照1:10比例稀釋，混勻后加入96孔板，每孔加稀釋血清50 μl，再加50μl相應的酶結合物，輕輕混勻，37℃孵育1 h，洗板，加顯色劑，37℃孵育30 min，終止顯色，酶標儀讀取450 nm吸光度。

1.4 小鼠肝臟內淋巴細胞分離 給予小鼠1%戊巴比妥200 μl腹腔注射，麻醉成功后，摘除眼球，取血約800μl，斷頸處死小鼠后，置于75%酒精中浸泡3 min，仰臥固定，切開皮膚和腹膜，充分暴露肝臟。通過門靜脈緩慢注射少量PBS后使肝臟顏色變為灰白色，剪斷下腔靜脈，取PBS 10 m l，緩慢灌洗肝臟，直至灌洗液中無血細胞流出。取小鼠肝臟于慮篩研磨肝臟，加入RPMI 1640培養基洗脫，加膠原酶II溶液于沉淀中，37℃溫箱中放置40 min，期間振蕩數次。然后，加冷DPBS，離心，重懸細胞沉淀于淋巴細胞分離液，離心，棄上清，用RPMI 1640培養基600μl重懸淋巴細胞，計數。

1.5 肝臟內CD4+T淋巴細胞FoxP3表達 取淋巴細胞，接種于 96 孔板，加抗 CD4-APC（1：100）50 μl，4℃避光 30 min。將dilution液與buffer液按照1：3混合，每孔100 μl，4℃孵育2 h，每孔再加100μl 1×buffer，洗滌。每孔加抗FoxP3（1:100）50 μl，4℃放置30 min。洗滌，PBS重懸，上流式細胞儀檢測。

1.6 統計分析 應用GraphPad Prism軟件作圖和SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，組間均數的比較采用兩獨立樣本的t檢驗，P＜0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組動物血清HBeAg和HBsAg水平變化 在高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2質粒后第1 d，小鼠血清HBsAg和HBeAg開始出現陽性，而第20 d時HBsAg和HBeAg已消失。在注射pAAV/HBV 1.2+IFNα后第1 d，血清HBeAg水平為（0.55±0.16），顯著低于pAAV/HBV 1.2組【（1.40±0.13），P＜0.05，圖 1）；在注射 pAAV/HBV 1.2+IFNα 后第 10 d，血清 HBsAg水平為（0.35±0.20），顯著低于 pAAV/HBV 1.2 組【（2.35±0.15），P＜0.05，圖 2）。

圖1 兩組小鼠血清HBeAg水平比較

圖2 兩組小鼠血清HBsAg水平比較

2.2 兩組動物血清HBsAb和HBcAb水平變化 在高壓尾靜脈注射后20 d，兩組小鼠血清HBsAb陰性（圖3）；在注射pAAV/HBV1.2后第10 d和20 d，競爭ELISA法檢測小鼠血清HBcAb呈陽性，而注射pAAV/HBV 1.2+IFNα小鼠血清HBcAb水平下降，但差異無統計學意義（P＞0.05，圖4）。

2.3 兩組動物肝內Treg變化 兩組小鼠肝內CD4+T淋巴細胞FoxP3表達未見顯著變化（圖5）。

圖3 兩組小鼠血清HBsAb水平變化

圖4 兩組小鼠血清HBcAb水平變化

圖5 兩組小鼠肝內CD4+T淋巴細胞FoxP3表達比較A：pAAV/HBV 1.2組；B：pAAV/HBV 1.2+IFNα 組

3 討論

盡管發現Ⅰ型IFN近60年了，它具有抗病毒作用和免疫調節作用，但是其作用機制尚不完全清楚[4]。IFNα是一個多能細胞因子，主要由單核細胞和B細胞經病毒誘導產生，與IFNAR結合，激活Jak/STAT信號通路，導致大量ISGs轉錄，表達多種抗病毒蛋白[5]。目前，臨床上所用的IFNα僅僅對部分乙型肝炎患者有效，說明IFNα可能具有極其復雜的抗病毒作用和免疫激活或免疫抑制功能[6]。

在高壓尾靜脈注射小鼠，IFN-α能抑制HBV復制，顯著抑制HBsAg和HBeAg表達，促進病毒的清除。IFNα與其受體結合，引發細胞膜上信號傳導，誘導抗病毒蛋白如OAS、MxA和PKR等表達，抑制肝細胞內病毒復制，促進病毒的清除。在HBV轉基因小鼠中，可能因免疫耐受等原因，IFNα對血清HBsAg水平無影響，但是，IFNα能顯著提高小鼠外周血CD4+T細胞和CD19+B細胞數量，發揮免疫調節作用[7]。

最近研究發現，Ⅰ型IFN具有免疫抑制作用[8-11]。在LCMV系統，持續性IFN信號驅動表達DC和巨噬細胞表達免疫抑制因子PDL1和IL10，而敲除IFNAR能暫時性升高病毒滴度，但最終的結果是促進病毒清除[12,13]。LCMV誘導產生的IFN活化STAT2而非STAT1，從而抑制DC增殖發育[14]。在結核菌持續感染小鼠，IFN誘導DC和巨噬細胞產生IL-10，抑制結核菌特異性免疫反應[15]。IFNα在HIV患者可誘導CD4+T細胞和記憶B細胞凋亡[16]。I型干擾素抑制病毒特異性CD4+Th1細胞免疫反應[17]。目前，IFNα治療慢性乙型肝炎的持續應答率不足40%。那么，IFNα是否誘導了免疫負調控的產生呢？

IFN-α在高壓尾靜脈注射小鼠未誘導免疫負調控。肝臟是一個免疫耐受器官[18]。我們不僅分離脾臟淋巴細胞，同時分離了肝臟內淋巴細胞。經流式細胞儀分析發現，肝臟內免疫負調控分子PD1和FoxP3表達沒有任何變化，這可能與我們使用的急性HBV感染小鼠模型有關。在體液免疫方面，IFN-α處理與否，兩種小鼠均未檢測到HBsAb產生，在該模型中HBsAb可能在病毒早期清除過程中未發揮作用，而HBcAb產生較早，高壓尾靜脈注射小鼠第4天就開始產生（數據未列出），這是因為HBcAg可以直接刺激B細胞產生抗體，無需抗原遞呈細胞[19]。IFN-α處理組HBcAb產生水平稍低，一方面原因是IFN-α可能抑制了HBcAg表達，從而導致抗體的減少；另一方面，IFN-α可能抑制了體液免疫應答。

[1] Liaw YF，Chu CM.Hepatitis B virus infection.Lancet，2009，373（9663）:582-592.

[2] Yang PL，Althage A，Chung J，et al.Hydrodynamic injection of viral DNA:a mouse model of acute hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（21）:13825-13830.

[3]Huang LR，Wu HL，Chen PJ，et al.An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（47）:17862-17867.

[4] Isaacs A，Lindenmann J.Virus interference.The interferon.Proc R Soc Lond B Biol Sci，1957，147（927）:258-267.

[5] Zoulim F，Durantel D.Antiviral therapies and prospects for a cure of chronic hepatitis B.Cold Spring Harb Perspect Med，2015，5（4）:232-236.

[6] 康富標，孫殿興，李東，等.干擾素-α2b治療非母嬰傳播HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者療效分析.實用肝臟病雜志，2016，19（4）：471-473.

[7] 嚴鑫，鐘銳華，劉錦紅，等.HBV轉基因小鼠體內淋巴細胞表型特點及干擾素α對其的影響.南方醫科大學學報，2016，36（6）：870-874.

[8] Snell LM，Brooks DG.New insights into type I interferon and the immunopathogenesis of persistent viral infections.Curr Opin Immunol，2015，34:91-98.

[9] Schreiber G，Piehler J.The molecular basis for functional plasticity in type I interferon signaling.Trends Immunol，2015，36（3）:139-149.

[10]McNab F，Mayer-Barber K，Sher A，et al.Type I interferons in infectious disease.Nat Rev Immunol，2015，15（2）:87-103.

[11]Crouse J，Kalinke U，Oxenius A.Regulation of antiviral T cell responses by type I interferons.Nat Rev Immunol，2015，15（4）:231-242.

[12]Wilson EB，Yamada DH，Elsaesser H，et al.Blockade of chronic type I interferon signaling to control persistent LCMV infection.Science，2013，340（6129）:202-207.

[13]Teijaro JR，Ng C，Lee AM，et al.Persistent LCMV infection is controlled by blockade of type I interferon signaling.Science，2013，340（6129）:207-211.

[14]Hahm B，Trifilo MJ，Zuniga EI，et al.Viruses evade the immune system through type I interferon-mediated STAT2-dependent，but STAT1-independent，signaling.Immunity，2005，22（2）:247-257.

[15]Mayer-Barber KD，Andrade BB，Oland SD，et al.Host-directed therapy of tuberculosis based on interleukin-1 and type I interferon crosstalk.Nature，2014，511（7507）:99-103.

[16]Cha L，Berry CM，Nolan D，et al.Interferon-alpha，immune activation and immune dysfunction in treated HIV infection.Clin Transl Immunology，2014，3（2）:e10.

[17]Osokine I，Snell LM，Cunningham CR，et al.Type I interferon suppresses de novo virus-specific CD4 Th1 immunity during an established persistent viral infection.Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（20）:7409-7414.

[18]Thomson AW，Knolle PA.Antigen-presenting cell function in the tolerogenic liver environment.Nat Rev Immunol，2010，10（11）:753-766.

[19]Milich DR，McLachlan A.The nucleocapsid of hepatitis B virus is both a T-cell-independent and a T-cell-dependent antigen.Science，1986，234（4782）:1398-1401.

（收稿：2016-11-20）

（本文編輯：陳宗炳）

Serum HBsAg and HBeAg changes in pCMV 2/IFN-α4 p lasm id-in fected m ice

Z hou Yun，Li Sheng，Tang Zongsheng，et al.Department of Infectious Diseases，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Hepatitis B；pCMV2/IFN-α4 plasmid；HBsAg；HBeAg；Mice

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.04.026

國家傳染病防治科技重大專項項目（編號：2008ZX10002-011）

430022武漢市 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院感染性疾病科（周云，李盛，唐宗生，楊東亮）；附屬同濟醫院實驗醫學中心（宋景嬌）；河南大學醫學院（周云）

周云，男，36歲，醫學博士。主要從事感染與免疫研究。E-mail:zyky120@126.com

宋景嬌，E-mail:jjsong@tjh.timu.edu.cn