不同遷徙能力奇異變形桿菌的比較蛋白質組學研究

唐 雨，劉艷霞 ，劉俊康，鄧 渝

（中國人民解放軍第三軍醫大學藥學院生藥學與天然藥物化學教研室，重慶 400038）

·實驗研究·

不同遷徙能力奇異變形桿菌的比較蛋白質組學研究

唐 雨，劉艷霞 ，劉俊康，鄧 渝

（中國人民解放軍第三軍醫大學藥學院生藥學與天然藥物化學教研室，重慶 400038）

目的 應用比較蛋白質組學的方法，檢測2種不同遷徙能力奇異變形桿菌變化顯著的差異蛋白，為深入研究奇異變形桿菌的耐藥性提供重要依據。方法 采用LB培養基培養遷徙能力不同的內環與外環變形桿菌，通過菌落直徑比值反映2種菌遷徙能力的差異；采用比較蛋白質組學的方法，檢測2種菌總體蛋白表達差異，并著重分析差異明顯的核糖蛋白各種類間的相互作用。結果 內環菌菌落直徑較小，外環菌菌落直徑較大，其菌落直徑比值為3.84±0.56；與內環菌相比，外環菌蛋白表達變化顯著，僅外環菌表達的蛋白29種，外環菌表達顯著下調的蛋白129種，顯著上調的蛋白269種；針對核糖蛋白分析發現，表達顯著增高的核糖蛋白種類有34種。結論 外環菌從形態到蛋白質表達均有顯著變化，其核糖體蛋白表達的顯著增加可能是其產生耐藥性的原因。

奇異變形桿菌；遷徙能力；比較蛋白質組學；耐藥

奇異變形桿菌是腸桿菌科變形桿菌屬的細菌，廣泛存在于人和動物的腸道內，是導致泌尿系統感染的第二大病原菌，僅次于大腸埃希菌[1]。同時，其致病機制為在感染部位大量繁殖并利用菌毛黏附于靶細胞表面，在靶細胞表面分化生長，并超量表達鞭毛和多糖莢膜，然后侵入細胞和細胞間質，釋放大量尿素酶、溶蛋白酶、溶血素等毒力因子，使受染細胞產生病變，最終導致相應組織和器官功能的異常，引起疾病[2]。奇異變形桿菌感染尿路后的治療較困難，雖然各種廣譜抗菌藥物可控制感染，但近年來，關于奇異變形桿菌耐藥的報道逐漸增多，且呈上升趨勢。有研究從耐藥菌株產生超廣譜β－內酰胺酶及AmpC酶等角度進行探索[3]，希望解決奇異變形桿菌的耐藥問題。本研究中為深入探討不同遷徙能力的奇異變形桿菌蛋白質表達的差異，尋找更為確切的耐藥靶點，為后續深入地研究耐藥分子機制提供依據，有利于解決其耐藥問題。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器：質譜系統（Thermo LTQ Orbitrap Elite）；液相系統（Thermo EASY－nlc1000）；Thermo EASY－Spray Column Pepmap C18柱，15 cm×75 μm，3 μm）；低溫高速離心機（美國 Thermo公司）；Milli－Q超純水機（美國Millipore公司）；超聲破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

材料：奇異變形桿菌(Proteus mirabilis，PM)由本實驗室保存。細菌裂解液（7 mol／L尿素，2 mol／L硫脲，4%CHAPS，0.2%Bio－Lyte，0.001%溴酚藍）；LB指示培養基（胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH＝7.2，1.5%瓊脂，0.05%TTC，0.1%葡萄糖）；LB無指示培養基（同LB指示培養基，無TTC溶液）。

1.2 細菌接種

已經高壓滅菌的LB培養基，待其溫度降至50℃左右時按比例加入TTC、葡萄糖混勻，制板后室溫冷凝，37℃倒置，敞口無菌烤板0.5 h，正中心點種奇異變形桿菌，37℃培養3 d。待接種的奇異變形桿菌波動生長3 d后，用接種針取內環菌和外環菌點種于LB指示培養基平板上，分別標記為A和B，37℃恒溫培養過夜。觀察不同區域細菌生長速度及遷徙能力。

1.3 不同遷徙能力菌體的比較蛋白質組學檢測[4]

1.3.1 樣品制備

按1.2項下方法取內環菌和外環菌，點種于LB無指示培養基上，收集2種不同遷徙能力的細菌，于4℃，以5 000 r／min的速率，離心10 min，收集菌體。用PBS洗1次，再次離心后，菌體加入適量含PMSF的細菌裂解液，0℃超聲裂解10 min，于4℃，以1 3 000 r／min的速率離心10 min，收集上清液，即為制備好的全細菌蛋白液。BCA法測定蛋白濃度。

1.3.2 蛋白質的變性、純化、烷基化、酶解及脫鹽

參照文獻[5－6]相關方法并加以改進。取樣品添加細菌裂解液及上樣緩沖液配制成質量濃度為3 g／L的蛋白樣品，96℃變性10 min，冷卻至室溫，每孔上樣60 μg，SDS－PAGE凝膠電泳約0.5 cm即停止，考馬斯亮藍染色、脫色后，切膠，每樣不超過1 cm2，置1.5 mL無菌離心管中，繼續脫色至無色，加乙腈脫水至膠粒變白，真空抽干，加10 mmoL DTT（25 mmol NH4HCO3）200 μL，56℃保溫1 h，冷卻至室溫，吸干，快速加IAA（25 mmoL NH4HCO3）200 μL，置暗室 45 min。依次用25 mmoL NH4HCO3（2次）、25 mM NH4HCO3＋50%乙腈（2次）、乙腈（1次），每次10 min。乙腈脫水至膠粒變白，真空抽干。將0.1 g／L酶液用25 mmoL NH4HCO3稀釋10～20倍，每管加20～30 μL，瞬時離心，使酶液和膠粒充分接觸，4℃放置30 min。待酶液被膠粒完全吸收，加25 mmoL NH4HCO3至總體積100～150 μL，37℃過夜。加1%TFA終止酶切，震蕩混勻，離心收集酶解液。

1.3.3 質譜檢測[5－6]

nano－LC－MS／MS液質聯用系統作比較蛋白質組學檢測。

色譜條件：液相系統為 Thermo EASY－nlc1000；質譜系統：Thermo LTQ Orbitrap Elite；分析柱為 C18色譜柱(15 cm×75 μm，3 μm)；進樣量為2 μL，流速為300 nL／min；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫，時間120 min。

質譜條件：電噴霧（ESI）離子源，噴霧電壓約為2.2 kV，毛細管溫度為250℃，碰撞能量35%，碰撞誘導解離（CID），正離子模式；由Tune and Xcalibur控制軟件根據數據依賴的自動模式實施一級和二級切換，一級質譜使用全質量掃描，m／z范圍300～1 800。

1.4 數據處理及生物信息學分析[5－6]

使用Thermo Proteome discoverer 1.4搜索引擎對數據庫進行檢索，檢索奇異變形桿菌種屬的ΜniProt數據庫；參數：相對分子質量范圍350～5 000，母離子分辨率10 mg／kg，子離子0.8，2個漏切位點的全酶切；信噪比閾值(S／N Threshold)1.5；固定修飾：半胱氨酸（烷基化）＋57.021 5；可變修飾：蛋氨酸（氧化）＋15.994 9；假陽性率（FDR）：0.01。采用SIEVE v2.1×64進行無標定量分析，尋找相關差異蛋白，根據實驗組與對照組豐度比值分析差異蛋白。選用 iProXpress(integrated protein expression)在線蛋白表達分析系統進行(Gene Ontology，GO）注釋的索引及細胞組分、過程、生物學功能、信號通路聚類的統計分析；尋找2種菌的差異蛋白；利用STRING(version 10，http:／／string－db.org／)數據庫進行蛋白－蛋白相關網絡分析。

2 結果

2.1 培養觀察結果

圖1 TTC指示劑培養觀察結果

圖2 不同區域菌體接種培養觀察結果

初始階段生長狀態與賈雄飛等[7]報道的增殖方式類似，但環間距稍大于其報道，后出現環間距增大的菌群，形如扇面（見圖1）。環間距小處于中央位置的為內環菌，間距大處于邊緣位置的為外環菌。不同區域菌體分別接種后，由菌落直徑可見，內環菌菌落直徑較小，外環菌菌落直徑較大，菌落直徑比值為3.84±0.56，說明外環菌與內環菌相比遷徙能力更強（見圖2）。

2.2 比較蛋白質組學檢測

凝膠電泳法去除電解質后，比較蛋白質組學檢測和分析，共鑒定到蛋白質1 003種，其中僅內環菌組表達的29種，僅外環菌組表達的29種，通過表達豐度比較，豐度減少少于50%的129種，豐度增加至2倍以上的269種，2種菌蛋白質表達變化不大的547種。結果顯示，外環菌相比內環菌的蛋白質表達情況發生了巨大變化。

實驗發現，2種菌在細胞形態方面呈現出極大差異，內環菌為短桿狀，外環菌則為細長桿狀。有研究對不同遷徙能力的奇異變形桿菌進行鞭毛染色觀察發現，遷徙速度更快的變形桿菌的鞭毛從數量及長度均遠超過遷徙速度慢的菌，提示兩者的蛋白質表達會有較大差異[8]。細胞內蛋白質合成的分子機器是核糖體，核糖體是細胞內一種核糖核蛋白顆粒，主要由rRNA和蛋白質構成，其唯一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質多肽鏈。核糖體蛋白種類的變化對細菌蛋白質表達的影響是關鍵的。因此本研究中著重分析外環菌比內環菌表達豐度顯著增加的核糖體蛋白并展示各蛋白間的相互作用（見圖3和表1）。

圖3 外環菌表達豐度增加2倍以上的核糖體蛋白相互作用圖

3 討論

由于無標記蛋白質組學檢測方法本身容易出現假陽性和定量不準的問題，采用內環菌與外環菌平行操作的方法保證可比性，同時在搜庫時設置信噪比閾值（S／N Threshold）1.5以去除背景。另因 iProXpress數據庫與STRING數據庫的差異，有9種在iProXpress中聚類的核糖蛋白種類未在STRING上識別。

表1 外環菌表達豐度增加2倍以上的核糖體蛋白注釋表

在固體培養基上培養奇異變形桿菌時，通常形態上會出現短桿狀菌與纖細長條狀菌之間的交替變化，分別為繁殖體（Vegeta－tive cells，VC）及潛生體（Cryptic growth cells，CGC）。劉俊康等[9]觀察到奇異變形桿菌節律性波動生長過程中表現潛－生序變化，潛生體可以回復到繁殖體，并以多位斷裂、自旋端位斷裂、出芽生長、梳狀繁殖等新的繁殖方式進行穩定性傳代。根據奇異變形桿菌的生長特性及細胞形態，初步判斷本試驗中的外環菌可能為該菌的潛生體，并能進行穩定傳代。有研究發現，奇異變形桿菌潛生體的耐藥程度普遍高于繁殖體，并從外膜通透性方面對該菌的耐藥機制進行了探索，認為外膜蛋白的大面積減少或缺失對潛生體耐藥程度的提高可能起著重要作用[10]。本研究中運用比較蛋白質組學檢測方法，對2種不同遷徙能力的奇異變形桿菌體內蛋白進行比對分析，外環菌中表達的核糖體蛋白比內環菌至少高3倍以上，通過展示顯著增加的各蛋白間的相互作用關系，以期為奇異變形桿菌容易發生耐藥問題提供新的靶點。

[1]Hola V，Peroutkova T，Ruzicka F.Virulence factors in Proteu bacteria from biofilm communities of catheter－associated urinary tract infections[J].FEMS Immunol Med Microbiol，2012，65（2）：343－349.

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[3]石蘭峰，鈕 博.奇異變形桿菌ESBL和AmpC酶的檢測與耐藥分析[J].中國廠礦醫學，2009，22(1):75－76.

[4]章常華，涂秀英，熊淑平，等.基于蛋白質組學技術篩選葛根芩連湯防治胰島素抵抗作用的血清差異表達蛋白[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（1）：81－85.

[5]劉艷霞，李雨濃，傅若秋，等.多柔比星對乳腺癌細胞核內絲切蛋白相互作用蛋白影響的比較蛋白質組學研究[J].第三軍醫大學學報，2017，39（6）：522－528.

[6]Capriotti AL，Caruso G，Cavaliere C，et al.Proteomic characterization of human platelet－derived microparticles[J].Anal Chim Acta，2013，776：57－63.

[7]賈雄飛，劉俊康，徐啟旺.奇異變形桿菌周期性群集運動的研究[J].第三軍醫大學學報，2005，27（9）：868－870.

[8]劉 蕾，劉艷霞，鄧 渝，等.同株奇異變形桿菌存在不同生長狀態[J].微生物學雜志，2011，31（4）：100－103.

[9]劉俊康，叢延廣，王 源，等.應用干涉相差顯微鏡觀察細菌潛生體繁殖方式的研究[J].第三軍醫大學學報，1999，21（1）：13－15.

[10]黃春基，徐啟旺，解曉珍，等.奇異變形桿菌潛生體與繁殖體的耐藥性差異及其機制探討[J].第三軍醫大學學報，1999，21（2）：106－108.

Comparative Proteomics of Proteus Mirabilis with Different M igratory Abilities

Tang Yu,Liu Yanxia,Liu Junkang,Deng Yu
(College of Pharmacy,3rd Military Medical University,Chongqing,China 400038)

Objective To detect differentially expressed proteins of two different migratory abilities of Proteus Mirabilis through comparative proteomics,to provide an important basis for further study on drug resistance of Proteus Mirabilis.M ethods LB medium was used to culture the inner and outer ring Proteus Mirabilis with different migratory ability,and the difference of migration ability between the two strains was determined by the ratio of colony diameter.Comparative proteomic analysis was used to detect the differences in overall protein expression between the two speciesofbacteria and to focuson the interaction between distinctclassesofribose proteins.Results The results showed that diameter of the inner colonies was small and the diameter of outer colonies was large.The colony diameter ratio were 3.84±0.56,compared with the inner ring,the outer ring of bacteria protein expression changes significantly, only the outer ring bacteria expressed 29 proteins,the outer ring of bacteria significantly down－regulation of 129 proteins and significantly up－regulation of 269 proteins.According to the analysis of ribosomal proteins,there were significant increase in expression of 34 kinds of proteins.Conclusion The morphology and protein expression of outer ring bacteria changed significantly,and the significant increase of ribosomal protein expression might be the cause of drug resistance.

Proteus Mirabilis;migratory abilities;comparative proteomics;drug resistance

2017－05－01)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.15.004

唐雨（1986－），女，碩士研究生，助教，主要從事天然藥物化學及其藥理作用研究，（電子信箱）tangyuflower＠163.com。

劉艷霞（1982－），女，碩士研究生，講師，主要從事天然產物抗腫瘤分子機制研究及新藥開發，（電子信箱）liuyibin＿04＠163.com。

Q935；R378

A

1006－4931(2017)15－0013－04