右美托咪定對膿毒癥患者外周血線粒體能量代謝相關基因表達的影響

鄧興，林名瑞，肖雄箭，林建東

（1.龍巖市第二醫院ICU，福建龍巖364000；2.福建中醫藥大學附屬人民醫院ICU，福建福州350004；3.福建醫科大學附屬第一醫院ICU，福建福州350005）

--論著--

右美托咪定對膿毒癥患者外周血線粒體能量代謝相關基因表達的影響

鄧興1，林名瑞2，肖雄箭3，林建東3

（1.龍巖市第二醫院ICU，福建龍巖364000；2.福建中醫藥大學附屬人民醫院ICU，福建福州350004；3.福建醫科大學附屬第一醫院ICU，福建福州350005）

目的基于PCR Assay芯片技術，分析右美托咪定對膿毒癥外周血線粒體能量代謝相關基因表達的變化并推論其可能的作用機制。方法選取50例老年嚴重膿毒癥病例，隨機分為右美托咪定治療組與生理鹽水對照組（常規治療組）。右美托咪定干預前與干預后1、3天所有患者靜脈采血立即提取RNA做PCR Assay基因芯片檢測。結果右美托咪定組與常規治療組相比，死亡率差異無統計學意義。經右美托咪定干預后，線粒體產能相關基因（如：Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha、Uqcrb、Cox8a、Atp5a1、Atp5i）從抑制轉為活躍表達，以彌補機體高代謝狀態下產能的減少。結論右美托咪定早期應用可調節機線粒體能量相關基因表達，使機體整體供能與應激期時能量代謝相匹配，從而起到對膿毒癥的保護作用，但并不減少膿毒癥患者死亡率。

膿毒癥；右美托咪定；線粒體；能量代謝；PCR Assay

膿毒癥3.0對膿毒癥作出了新的釋義，即膿毒癥系感染基礎上出現一定程度的器官功能障礙[1]。膿毒癥作為危重病領域的常見病，引起危重病醫學界的極大重視。盡管近年危重病專家對膿毒癥的認識及治療方式的改進，膿毒癥患者死亡率有所下降，但隨著人口老齡化發展，膿毒癥的發病率卻呈上升趨勢，繼而使膿毒癥死亡人數呈逐年上升趨勢[2]。繼往研究顯示：膿毒癥早期，機體氧耗往往增加，但由于毛細血管滲漏致機體容量相對不足，導致機體組織器官有效灌注不足，進而引起組織缺氧，這更進一步加劇機體缺氧。線粒體因缺氧不能有效地驅動ADP氧化磷酸化為ATP，從而引起機體產能的減少，同時也可觸發細胞死亡[3]。右美托咪定（DEX）屬于高選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑中的一種，在臨床鎮靜、抗焦慮方面有一定的歷史[4]。繼往動物實驗研究顯示右美托咪定可使線粒體功能障礙大鼠受益[5]。但對于膿毒癥早期使用右美托咪定鎮靜是否可改善外周血中線粒功能障礙國內外仍少見，本研究擬從基因水平對右美托咪定對膿毒癥患者外周血線粒體能量代謝作用相關機制作一探討。

1 資料與方法

1.1 實驗方法選取2015年1月～2015年12月龍巖市第二醫院重癥醫學科收治的50例老年嚴重膿毒癥患者，隨機分為右美托咪定治療組（A組）與生理鹽水對照組（常規治療組，B組），各25例。嚴重膿毒癥患者的準入標準參照中國嚴重膿毒癥/膿毒性休克治療指南（2014）[6]。排除標準為合并外傷、免疫缺陷性疾患、乙肝表面抗原陽性、嚴重心血管疾病、終末期肝腎疾病、惡性腫瘤、長期使用鎮靜催眠藥物及近3個月內使用激素或免疫抑制劑史。本研究符合醫學倫理學標準，經醫學倫理委員會批準，并獲得患者家屬的知情同意。隨機選取10例健康體檢老年人作為健康對照組（C組）。1.2臨床資料本實驗研究最終共納入50例老年嚴重膿毒癥患者，A組與B組在年齡、性別、APACHEⅡ評分等比較差異均無統計學意義。見表1。

表1 臨床資料（x±s）Table 1 General clitical data(x±s)

1.3 治療方法所有患者均在入ICU并給予常規重癥監護、抗生素治療、復蘇、維持內環境穩定等一般治療。A組則先予右美托咪定負荷量2.5μg/(kg·h)的速度靜脈泵入，后改用0.2～0.7μg/(kg·h)的速度持續靜脈泵入鎮靜，B組患者除了未予右美托咪定外其他治療均相同，同時予同B組同等量的生理鹽水進行對照。用藥前與用藥后1、3天所有患者靜脈采血5 mL，取其中3 mL血液立即分離線粒體后提取RNA，-80℃保存，待做基因芯片檢測。

1.4 觀察指標及方法能量代謝相關基因表達量檢測。按組及取材時間為單位，隨機取10標本的RNA，進行混勻后，進一步提取mRNA，取2μg mRNA使用superscriptⅡ和Random Primer Hexamers（Invitrogen）反轉錄合成并純化cDNA。然后在PCR Array的96孔板中各加入20 ng cDNA，依RT2Profiler?PCR Array使用說明設置循環數并進行PCR并計算出每個孔板中的Ct數。采用ΔΔCt方法計算每個處理組中的每個通路相關基因的ΔCt。ΔCt(group 1)= average Ct-average of HK genes’Ct for group 1 array ΔCt(group 2)=average Ct-average of HK genes’Ct for group 2 array。計算2個PCR Array（或兩組）中每個基因的ΔΔCt。ΔΔCt=ΔCt(A組)-ΔCt (B組)。同過2-ΔΔCt計算組2與組1對應基因的表達差異。

1.5 統計學方法采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，計量資料采用“x±s”表示，組間及組內比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床治療及轉歸統計結果顯示A組患者平均住院時間(15.72±5.04)與B組（15.76±3.95）接近（P=0.401）；兩組患者28 d死亡率（0.24 vs 0.32）（P=0.529）。患者最終死亡原因多數為MODS。

2.2 相對于C組，A、B組Fold值改變情況右美托咪定干預后Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha、Uqcrb、Cox8a、Atp5a1、Atp5i的Fold絕對值趨向于升高趨勢，而B組治療前后，絕大多數Fold值變化并不大。見表2。

表2 相對于C組，右美托咪定干預前后及B組治療前后相關有意義基因的表達情況Table 2 Compared to C group，the expression of related significant genes of before and after dexmedetomidine intervention and before and after treatment of B group

3 討論

膿毒癥是危重病，仍是重癥醫學科主要病種之一，具有極高的死亡率[2]。盡管隨著其病理生理研究的深入及相關生命支持的進步，但其病死亡率仍不容忽視。研究顯示，膿毒癥引起的全身炎癥反應綜合征往往會導致細胞內熱休克蛋白，組蛋白，DNA，線粒體等功能相應受損[7]。近年來研究指出，關于膿毒癥與機體代謝盯著研究指出，系統性炎癥反應可以以不同的方式影響線粒體：①在感染性休克灌注受損的早期，由于內在和外在的液體損失和攝入減少，血管張力減少，心肌收縮受抑制，微循環血流量重新分配能力喪失，這可致組織缺氧，即在線粒體內氧不足以驅動ADP的氧化磷酸化的ATP。雖然特殊的酶特性的復合物IV可以在氧氣濃度較低時發揮有效功能，但非常低的水平可能會影響ATP的生成從而成為觸發細胞死亡潛在的通路[8]。②NO，硫化氫，和其他活性氧過量產生直接抑制線粒體呼吸和直接損害線粒體蛋白和其他結構如脂質膜。一氧化氮和過氧亞硝基陰離子也被證明具有變化對其他呼吸鏈酶的影響[9]。③膿毒癥中激素的改變對線粒體功能和效率的影響。例如，甲狀腺激素被認為主要是發揮它的作用，通過調節線粒體功能，即在膿毒癥早期，機體甲狀腺功能就有可能受影響，即重癥感染可引起“SES”或“低T3綜合征”[10]。這在臨床工作中也得到認可。

研究顯示，膿毒癥時，機體代謝加快，然而，因炎癥反應相關的一系列級聯反應嚴重影響機體線粒體的功能，進而引起機體能量生成障礙。這種供需矛盾，更進一步加重機體組織器官功能的障礙。右美托咪定作為一種α2-腎上腺素受體激動劑，主要涉及抑制去甲腎上腺素的釋放和神經元的興奮，可一定程度上抑制SIRS進一步發展[11-12]。例如：M Peng等人研究發現右美托咪定是一種有效的抑制脂多糖誘導的小膠質細胞活化的炎癥[13]。另有研究發現，在心臟搭橋手術中，應用右美托咪定可減少機體產生IL-1，IL-6，TNF-α[14]。

本研究發現，膿毒癥時，線粒體產能相關基因（如：Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha、Uqcrb、Cox8a、Atp5a1、Atp5i）表達受到一定程度的抑制，這從一定程度上抑制了線粒體呼吸，從而致使機體產能減少。經右美托咪定干預后，此基因表達水平升高明顯，以彌補機體高代謝狀態下產能的不足，而常規治療，這些基因表達上調輻度相對較低，甚至仍以抑制為主。因此，右美托咪定可能通過調節線粒體產能相關基因的表達，從而起到維持機體代謝水平，

綜上所述，膿毒癥時機體線粒體產能相關基因表達明顯受抑，右美托咪定可能通過調節線粒體產能相關基因的表達，從而起到對膿毒癥患者保護作用,但并不減少膿毒癥患者死亡率。

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Effect of dexmedetomidine on expression of mitochondrial energy metabolism related genes of peripheral blood in septic patients

Deng Xing1,Lin Ming-rui2,Xiao Xiong-jian3,Lin Jian-dong3
(1.Intensive Care Unit,The Second Hospital of Longyan,Longyan,Fujian,364000,China;2.Intensive Care Unit,TheAffiliated People’s Hospital of Fujian Traditional Medical University,Fuzhou,Fujian,350004,China;3.Intensive Care Unit,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou,Fujian,350005,China)

Objective To analyze the changes of mitochondrial energy metabolism related genes of peripheral blood in septic patients were under Dexmedetomidine treatment based PCR Assay chip technology and to find its possible mechanism.Methods 50 cases of severe septic patients were selected.The patients were randomly divided into the Dexmedetomidine treatment group and normal saline control group(conventional treatment group).Before Dexmedetomidine given and 1,3 days post-intervention,venous blood of all patients was collected immediately and extract RNA,and then to do PCR Assay cDNA microarray.Results There was no significant difference in mortality between the dexmedetomidine group and the conventional treatment group.The expression of mitochondrial production-related genes(Ndufa1,Ndufab1,Ndufb2,Ndufs8,Sdha,Uqcrb, Cox8a,Atp5a1,Atp5i)are actived from inhibition to make up for the body's high metabolic capacity reduction.Conclusion Early application of Dexmedetomidine can regulate the expression of genes related to mitochondrial energy-related genes to match the body of the overall energy supply with energy metabolism during the stress period,which can protect the sepsis,but does not reduce the mortality of patients with sepsis.

Sepsis;Dexmedetomidine;Mitochondrion;Energy metabolism;PCRAssay

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.24.001

中華醫學會臨床醫學科研專項資金-國瑞重癥科研項目（13091440529）

林建東，E-mail：linjd@tom.com