山羊肺泡巨噬細胞的分離、培養與鑒定

吉小芳，俞慧清，岳亮亮，徐旭俊，陳建泉，成國祥，劉宗平

技術方法

山羊肺泡巨噬細胞的分離、培養與鑒定

吉小芳1,2，俞慧清1*，岳亮亮1,3，徐旭俊1，陳建泉1，成國祥1，劉宗平2

巨噬細胞是機體造血系統中可塑性較強的細胞，存在于機體的多個組織中，并且具有強大的功能多樣性。巨噬細胞具有吞噬和消化病原體、感染細胞及死亡細胞碎片、募集和調節其他免疫細胞參與炎性反應及幫助組織修復等功能[1,2]。當機體受到抗原刺激時，血液中的單核細胞在趨化因子的引導下，進入抗原侵入的局部組織，進一步分化成各類炎癥巨噬細胞。

肺泡巨噬細胞是機體抵抗病原微生物侵襲肺臟的第一道防線，接觸到致病因子后，肺泡巨噬細胞伸出偽足將其包圍形成封閉小體，與細胞內大的溶酶體融合，達到殺死致病因子的目的。但有一些致病因子在進化過程中，產生了抵御機體免疫的機制，如結核桿菌中的硫酸鳥苷酯可抑制巨噬細胞中吞噬體與溶酶體結合，使結核桿菌在巨噬細胞中長期生存[3]。另一方面，肺泡巨噬細胞還參與特異性免疫[4,5]，對抗原進行加工提呈，分泌多種細胞因子調節、啟動炎性反應，是研究肺部感染的重要細胞模型。

目前，已有關于小鼠、豬、牛等巨噬細胞分離培養方法的報道[6-9]，但關于山羊肺泡巨噬細胞的體外分離培養仍有待充實。本研究旨在前人研究的基礎上，結合肺氣管灌洗及密度梯度離心，從山羊肺臟中獲得高純度、高活性的肺泡巨噬細胞，為深入研究巨噬細胞的生物特性和抗胞內菌的免疫功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

山羊由上海轉基因研究中心實驗羊牧場提供，本研究方案獲得上海轉基因研究中心動物倫理委員會批準[No.G2016-05]；羊外周血單核細胞分離液、羊巨噬細胞培養基均購自天津市灝洋生物制品科技有限公司；胰酶、小牛血清均購自GIBCO公司；臺盼藍、4%多聚甲醛等均為國產分析純試劑；雞紅細胞從家雞靜脈取得,與Alseveve液按1∶4比例混合于4度保存備用；瑞氏-姬姆薩復合染液購自上海歌凡生物科技有限公司，熒光標記抗羊CD14抗體(ab186689)購自于Abcam公司；BD FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產品，流式細胞檢測委托上海張江公共服務平臺進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 山羊肺巨噬細胞的分離培養

采取新鮮山羊肺臟，將肺臟提起保持不動，結扎氣管，用200 mL無菌PBS通過氣管沖洗肺臟內部，每次50 mL，重復4次。沖洗過程中適當輕輕按摩肺葉，使肺巨噬細胞慢慢釋放出來，將含巨噬細胞的沖洗液收集到入一個預冷的燒杯中，用雙層無菌紗布過濾除去雜質。若濾液混有部分血細胞，再用外周血單核細胞分離液處理濾液，具體步驟可參考分離液說明書。簡要地，先向滅菌離心管中依次加入分層試劑A和D，再加入肺泡濾液，使各液面清晰分層，然后離心30 min，小心吸取第二層試劑D層和第三層乳白色細胞層，加入 PBS洗滌兩次，收集細胞。

懸浮細胞進行細胞計數，用預熱的羊巨噬細胞培養液將細胞濃度調整到0.5×106個/mL，置于6 cm2的組織培養皿中，于5% CO237℃溫箱培養。1～2 h后更換培養基，去除未貼壁的淋巴細胞，繼續培養。

1.2.2 臺盼藍染色檢測細胞存活率

將0.4%的臺盼藍染液與等體積細胞懸液混合，染色2～3 min，取1滴混合懸液于細胞計數器內。鏡下觀察可見，死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染，計數藍染細胞和未藍染細胞。

1.2.3 肺泡巨噬細胞培養特性觀察

細胞培養后,每日用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化及生長狀況。培養四周后，采用姬姆薩染色，進一步觀察細胞形態。

1.2.4 吞噬雞紅細胞試驗

將分離培養兩小時的細胞取一部分進行雞紅細胞吞噬試驗，約1×105個細胞懸浮于2 mL培養液中；將5%的雞紅細胞用培養基洗滌兩次，加入0.5 mL至巨噬細胞懸液中，混合后將細胞移置培養皿中，置于5% CO237℃溫箱孵育；1 h后輕輕吹打，收集細胞。將混合細胞懸液涂片，晾干后采用瑞氏-姬姆薩復合染液染色細胞，具體操作見說明書。染色后細胞置于顯微鏡下觀察，分析細胞吞噬情況。細胞吞噬百分率按以下公式計算: 細胞吞噬率(%)=吞噬細胞/(吞噬細胞+未吞噬細胞)×100%。1.2.5 流式細胞術分析細胞純度

體外培養四周后，取部分細胞用0.25%的胰酶將巨噬細胞消化下來， 800 rpm離心5 min，用冰冷的PBS洗一次；用1 mL含5% FBS的PBS重懸細胞，冰上孵育10 min，800 rpm/min離心5 min；用 200 μL含5% FBS的PBS重懸1×106個細胞，加入 10 μL 的抗羊CD14抗體，避光孵育1 h。800 rpm離心5 min，去上清，加入1 mL含5% FBS的PBS重懸細胞，再次離心去上清，重復3次，最后一次用200 μL含5% FBS的PBS重懸細胞，實驗設經相同方法處理的肺成纖維細胞作對照，流式細胞儀上檢測細胞表面CD14表達水平，流式檢測委托上海張江公共服務平臺進行。

2 結果

2.1 分離細胞的培養與形態觀察

分離的細胞經臺盼藍染色，極少數細胞呈藍染，平均95%以上細胞均未著色，細胞形態飽滿，為狀態較好的活細胞。鋪板后兩小時可觀察到不規則形的細胞貼滿培養皿，同時也有一些圓形的未貼壁細胞浮在上面；更換培養基，洗去未貼壁細胞繼續培養，兩天后可見細胞有所收縮，體積較小，多數細胞伸出較短偽足，形態變得不規則，折光性較好(圖1A)；細胞培養一周,細胞體積有所增大，貼壁牢固，伸出的偽足多種多樣，呈橢圓形、星形、梭形或不規則形，胞漿豐富(圖1B)；培養四周后，細胞體積進一步增大，大部分細胞呈煎蛋狀，胞質內出現空泡，細胞開始老化(圖1C)。

注：(A)經篩選后培養兩天的細胞，細胞開始伸出觸角；(B)培養一周的細胞，細胞形狀多樣，貼壁牢固，胞質豐富，偽足突出；(C)培養四周的細胞，呈煎蛋狀，胞質內有空泡；(圖1A，B，C放大倍數均為×100)。圖1 體外培養的肺泡巨噬細胞不同時期形態圖(Bar=50 μm)Note.(A)Cells cultured for 2 days, stretched out tentacles；(B)Cells cultured for one week, being morphologically diverse, adherent firmly, cytoplasm rich, and with prominent pseudopodia；(C)Cells cultured for 4 weeks, like an omelette,contain vacuoles.Fig.1 Morphology of alveolar macrophages at different stages

圖2 體外培養近一個月的巨噬細胞經姬姆薩染色(×200)Fig.2 Macrophages cultured in vitro for about one month. Giemsa staining.

注：白色箭頭所指為正在吞噬多個紅細胞的巨噬細胞，灰色箭頭所指為雞紅細胞。圖3 羊巨噬細胞吞噬雞紅細胞 (瑞氏-姬姆薩復染，×400)Note. The white arrow indicates a macrophage that phagocytosed many red blood cells. The grey arrow refer to chicken red blood cells.Fig.3 Goat macrophages engulfed chicken red blood cells. Wright-Giemsa stained

將體外培養一個月的巨噬細胞在培養皿內進行姬姆薩染色，可見細胞著色較深，大小不一，大部分呈煎蛋狀，偽足較短。

2.2 吞噬雞紅細胞試驗

將分離培養的細胞進行雞紅細胞吞噬試驗，孵育1 h后收集細胞，采用瑞氏-姬姆薩復合染液染色，在油鏡下觀察。在細胞涂片中可見雞紅細胞的細胞核染成較深的藍色，胞漿紫紅色；羊巨噬細胞整體染成藍色，細胞較大。巨噬細胞吞噬了一個或多個雞紅細胞，在胞漿中形成吞噬體，雞紅細胞邊緣被巨噬細胞溶酶體消化，紅細胞核染色較深；有些紅細胞附著在巨噬細胞周邊，有些已經正在被包裹形成吞噬體(圖3)。雞紅細胞吞噬結果表明分離的羊肺泡巨噬細胞具有很強的吞噬作用，計數200個細胞，平均54.5%的巨噬細胞吞噬了或者正在吞噬雞紅細胞。

2.3 流式細胞術分析巨噬細胞純度

收集體外培養四周的羊巨噬細胞，并以肺成纖維細胞作陰性對照，消化后與熒光標記的抗羊CD14抗體共孵育，在流式細胞儀(BD FACSCalibur)上檢測山羊肺泡巨噬細胞CD14表達水平，結果見圖4、5。圖4所示，收集的山羊肺泡巨噬細胞中有93.7%的細胞表達了CD14；圖5所示，收集的對照成纖維細胞中只有0.26%的細胞表達了CD14；M1為熒光標記陰性區間，M2為熒光標記陽性區間。實驗表明，本研究經體外培養獲得了高純度的巨噬細胞。

3 討論

巨噬細胞是機體天然免疫系統的重要組成部分，具有吞噬殺傷、遞呈抗原、啟動免疫應答及抗腫瘤等功能[10]，成功分離肺泡巨噬細胞，對深入了解巨噬細胞如何抵抗病原體研究提供了重要的材料，有助于對疾病的預防與控制。

注：(a)流式細胞收集圖；(b)流式結果分析圖。圖4 肺泡巨噬細胞表面CD14表達情況Note.(a)Flow cytometric map of cell collection；(b)Flow cytometric analysis chart.Fig.4 Expression of CD14 on alveolar macrophages

注：(a)流式細胞收集圖；(b)流式結果分析圖。圖5 肺成纖維細胞表面CD14表達情況(對照)Note.(a)Flow cytometric map of cell collection；(b)Flow cytometric analysis chart.Fig.5 CD14 expression on the surface of lung fibroblasts(Negative control)

巨噬細胞分離過程中常會有血紅細胞及成纖維細胞的污染，培養過程中肺成纖維細胞分裂旺盛，生長快，體外培養很容易成為優勢細胞，從而抑制巨噬細胞的生長。本研究在用PBS灌注分離肺泡中的巨噬細胞時，增加了巨噬細胞分離液密度梯度離心的步驟，根據巨噬細胞與紅細胞及成纖維細胞密度的微小差異，利用單個核細胞分離液進行分離，離心后形成多個液面分層，選擇單核細胞層進行貼壁培養，從而去除了血紅細胞及肺泡成纖維細胞的污染，成功獲得了高純度的肺泡巨噬細胞。體外培養的巨噬細胞經顯微鏡下觀察，細胞形態豐富多樣，有偽足和突起伸出，胞漿豐富，具有典型的巨噬細胞形態特征。

吞噬功能是檢驗巨噬細胞活力的重要方法之一，張華等[7]向小鼠腹腔注射雞紅細胞，進行巨噬細胞吞噬試驗，間隔12 h后收集細胞，發現紅細胞吞噬率為26.0%；韓忠燕等[8]將巨噬細胞與雞紅細胞共孵育16 h后收集細胞，發現23.6%的細胞吞噬了雞紅細胞。本研究將分離培養的山羊肺泡巨噬細胞進行雞紅細胞吞噬試驗，37℃共孵育1 h后收集細胞，發現巨噬細胞吞噬率為54.5%。本研究結果相比之前報道的效率稍高，可見進行巨噬細胞吞噬試驗時，影響吞噬結果的不僅有細胞活性，還有兩種細胞共孵育的時間、數量比等。吞噬是一個動態的過程，若兩者共孵育時間過長，部分巨噬細胞已經崩解，觀察到的吞噬率會偏低；本研究中雞紅細胞量較多，大部分巨噬細胞都吞噬了多個雞紅細胞。

CD14是一種通過糖基磷脂酰肌醇錨定于細胞膜表面的糖蛋白，分布于單核細胞、巨噬細胞膜表面脂質豐富的區域，而在內皮細胞等表面則未發現CD14的存在，目前已被廣泛用來鑒定單核巨噬細胞[12,13]。陳玉惠等[9]將牛外周血單核巨噬細胞在體外分化培養后，流式檢測其表面CD14的陽性率為62.43%，林煒明等[11]用免疫磁珠法分離外周血單核細胞，CD14的陽性率從分選前的10%提高到85.8%；本研究中分離的山羊肺泡巨噬細胞在體外培養近一個月后，其表面經檢測有93.76%的細胞表達CD14，說明培養的巨噬細胞仍具有其固有的免疫學特性，并且純度極高，無其它細胞污染。

本研究通過PBS灌注法，結合密度梯度離心，成功的從山羊肺臟中分離了高純度的CD14+肺泡巨噬細胞，肺泡巨噬細胞在體外形態多樣，有偽足和突起伸出，呈典型的巨噬細胞特征；分離培養的細胞具有很好的吞噬活性及生物學特性，為巨噬細胞相關的疾病機理的研究提供了材料。

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(1.上海轉基因研究中心，上海 201203； 2.揚州大學獸醫學院，揚州 225009； 3.揚州大學生物科學與技術學院，揚州 225009)

目的 建立一種高純度的肺泡巨噬細胞分離培養方法，為研究巨噬細胞生物學特性，開展細胞內寄生菌存活機理研究提供材料。方法 在無菌環境下以PBS多次灌洗山羊肺臟，收集細胞后，用外周血單核細胞分離液結合密度梯度離心法從混合細胞中分離出羊肺泡巨噬細胞；培養于含10%胎牛血清的細胞培養基中，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并利用其對雞紅細胞的吞噬功能檢測細胞活性；采用流式細胞術檢測單核巨噬細胞表面特征性標志CD14。結果 獲得的貼壁細胞具典型的巨噬細胞形態學特征，有偽足和突起伸出，呈現圓形及不規則形狀，胞漿豐富，胞體較大；培養的巨噬細胞54.5%吞噬了雞紅細胞，具有較強的吞噬活性；在體外連續培養近一個月，仍有93.7%的細胞能特異性表達CD14抗原，具有巨噬細胞特異性免疫表型。結論 本研究獲得的山羊肺泡巨噬細胞純度高、生物活性好，為開展細胞內寄生菌的疾病機理研究提供了細胞模型。

山羊；巨噬細胞；分離培養；形態學觀察；體外吞噬；流式細胞鑒定

Isolation, culture and identification of goat alveolar macrophages

JI Xiao-fang1,2， YU Hui-qing1*， YUE Liang-liang1,3， XU Xu-jun1， CHEN Jian-quan1， CHENG Guo-xiang1， LIU Zong-ping2
(1.Shanghai Transgenic Research Center，Shanghai 201203, China； 2.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009； 3.College of Biological Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009)

Objective In order to study the biological characteristics of macrophages and provide the materials to study the survival mechanism of intracellular parasites, we conducted this study to establish a high-purity alveolar macrophage isolation and culture method.Methods Goat lungs were lavaged with normal saline in sterile environment several times, and cells were collected and then goat alveolar macrophages were purified by density gradient centrifugation using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) solution. The isolated goat alveolar macrophages were cultured in cell culture medium containing 10% fetal bovine serum and cell morphology was observed under an inverted microscope every day，and the phagocytic activity of the cells was detected by chicken red blood cell phagocytosis test. Flow cytometry was used to detect CD14, a characteristic monocyte-macrophage surface marker.Results The adherent cells were characterized by typical macrophage morphology, pseudopodia and protrusions, showing round and irregular shape, rich cytoplasm, and large cell body. Of the cultured macrophages, 54.5% could phagocytize chicken erythrocytes and showed good phagocytic activity. After one month of in vitro culture, 93.7% of the cells were able to express CD14 antigen, which had a macrophage-specific immunophenotype. Conclusions The alveolar macrophages obtained in this study have high purity and good bioactivity, thus provide a cell model for studying the immune mechanism of intracellular parasites.

Goat; Alveolar macrophage; Isolation and culture; Morphology; In vitro phagocytosis; Flow cytometry

國家轉基因重點專項(2014ZX0800801B)；上海市科技興農攻關項目(滬農科攻字2014第7-1-12號)。

吉小芳(1990-)，女，碩士生，研究方向：轉基因動物與生物制藥。E-mail： 15205275290@163.com

俞慧清(1974-)，副研究員，博士，研究方向：轉基因動物與生物制藥。E-mail： yhq202@hotmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0075-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.015

2016-12-12