實驗動物四種病原體多重PCR方法的建立與應用

祝巖波，徐增年，魏世錦，鄭 龍，尤紅煜，孟鈺榕，劉福英，梁曉亮，王俊霞*

技術方法

實驗動物四種病原體多重PCR方法的建立與應用

祝巖波1，徐增年1，魏世錦2，鄭 龍1，尤紅煜1，孟鈺榕1，劉福英1，梁曉亮3，王俊霞1*

多殺巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、支氣管鮑特桿菌(Bordetellabronchiseptica)、支原體(Mycoplasmapneumoniae)和肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)是實驗動物的常見病原微生物，能引起許多哺乳動物呼吸系統的隱性感染甚至死亡[1]。近幾年實驗動物質量監測結果顯示，以上四種病原微生物陽性時有發生[2-4]。目前我國實驗動物微生物等級及監測標準為多殺巴氏桿菌(GB/T 14926.5-2001)，支氣管鮑特桿菌(GB/T 14926.6-2001)，支原體(GB/T 14926.8-2001)，肺炎克雷伯桿菌(GB/T 14926.13-2001)。上述四種病原微生物采用的檢測方法是傳統的分離培養和生化鑒定方法，此種方法費時費力，而且實驗人員需要具備較高的專業素質，因此急需建立一種更為簡便，快速的檢測方法。目前分子生物學方法對于細菌、病毒的檢測已得到廣泛應用，四種病原微生物的單一PCR方法已有報道，但同時檢測四種病原微生物的方法尚未建立[6，8-15]，本研究建立了能夠同時檢測上述四種病原微生物的多重PCR方法并且完成初步應用，為其快速檢測和診斷提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

本實驗所用肺支原體(NCTC10540)由中國食品藥品檢定研究院惠贈，多殺巴氏桿菌(K8123)購自溫州康泰生物科技有限公司，支氣管鮑特桿菌(CGMCC1.2418)購自中國微生物菌種保藏中心，肺炎克雷伯桿菌(CMCC46117)購自廣東省微生物菌種保藏中心。金黃色葡萄球菌(ATCC6538)由石家莊市疾控中心惠贈。乙型溶血性鏈球菌(CMCCB32210)、乙型副傷寒沙門氏菌(CMCCB50094)、大腸埃希菌(CMCC44102)、肺炎鏈球菌(CMCCB31001)購自北京北納創聯生物技術研究院。

1.1.2 動物樣本

隨機抽檢河北省實驗動物中心和山西省實驗動物中心45只清潔級實驗動物的氣管及分泌物和鼻棉拭子，其中包含20只小鼠，5只大鼠，10只兔，5只豚鼠，5只地鼠，動物購買后于開放環境中飼養數日。

1.1.3 引物

根據多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌的特異性區域設計相應引物，引物基因、引物序列、產物長度和文獻出處見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 主要試劑與儀器

DHL瓊脂平皿，血瓊脂平皿，支原體培養基，均購自北京三藥科技開發公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司；細菌生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；Mix購自康為世紀；Tris購自Solarbio公司；DNA Ladder購自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖Agarose購自BIOWEST公司；核酸染料ExRed購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；支原體ELISA檢測試劑盒購自蘇州西山生物技術有限公司。

表 1 引物序列

再鑫儀器有限公司生物安全柜；上海躍進醫療器械廠PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養箱；NanoDrop 基因公司ND-1000 Spectrophotometer；美國UVPGDS-8000凝膠成像系統；北京君意東方電泳設備有限公司JY600E電泳儀；美國GeneAmp 9700PCR；德國 Heraeus高速冷凍離心機；無錫縣電化教具廠JLQ-S1菌落計數器。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌DNA的提取

多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌四株標準菌株復蘇培養后，用天根細菌基因組DNA提取試劑盒按照使用說明提取基因組DNA。經紫外分光光度計檢測，測取各菌株的濃度，并將各菌株濃度稀釋為10 ng/μL。

1.3.2 氣管分泌物和鼻棉拭子DNA的提取

將動物氣管浸泡在酵母浸出液中，或將鼻棉拭子泡在酵母浸出液中震蕩，其余按天根細菌基因組DNA提取試劑盒使用說明提取基因組DNA。

1.3.3 PCR反應體系和反應條件

PCR反應體系為50 μL，包括：Mix 25 μL，引物濃度分別為多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌0.2 μmol/L，DNA各10 ng。反應條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共30 個循環; 72℃ 7 min。PCR產物在2.5% 瓊脂糖凝膠中，120 V 電泳30 min。

1.3.4 特異性檢測

用所建立的多重PCR體系分別擴增金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌分離株來檢測所建方法的特異性。

1.3.5 敏感性檢測

將四種病原體的DNA按1:10的比例進行稀釋，稀釋后濃度分別為10 ng/μL,1 ng/μL,100 pg/μL,10 pg/μL,1 pg/μL,100 fg/μL，同時設置陰性空白對照，檢驗多重PCR的敏感性。

1.3.6 應用

用四種病原體多重PCR方法檢測5種人工感染樣本和45例實驗動物氣管及分泌物和鼻棉拭子。

1.3.7 血清學方法

根據肺支原體ELISA檢測試劑盒操作檢測肺支原體的感染情況。

1.3.8 傳統培養方法

取氣管分泌物和鼻咽棉拭子分別涂在血平皿培養36～48 h和DHL瓊脂平皿18～24 h，根據國家標準多殺巴氏桿菌(GB/T 14926.5-2001)，支氣管鮑特桿菌(GB/T 14926.6-2001)，肺炎克雷伯桿菌(GB/T 14926.13-2001)鑒定三種病原體的感染情況。

2 結果

2.1 特異性

用建立的多重PCR方法擴增金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌，結果顯示僅第一管擴增目的條帶，無其他陽性產物(見圖1)。

2.2 敏感性

四種病原微生物多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌多重PCR敏感性實驗結果顯示，肺炎克雷伯桿菌DNA最低檢測質量均為10 pg，其他三種DNA最低檢測質量均為1 pg，見圖2。四種病原微生物單重PCR的敏感性結果顯示肺炎克雷伯桿菌DNA最低檢測質量均為10 pg，其他三種DNA最低檢測質量均為1 pg，見圖3。

注：(M)100 bp DNA Ladder；(1)陽性對照;(2)金黃色葡萄球菌；(3)乙型溶血性鏈球菌；(4)乙型副傷寒沙門氏菌;(5)大腸埃希菌；(6)肺炎鏈球菌。圖1 多重PCR特異性Note.(M)100 bp DNA Ladder;(1)Positive control；(2)Staphylococcus aureus；(3)β-hemolytic streptococcus;(4)Salmonella paratyphi;(5)Escherichia coli;(6)Streptococcus pneumoniae.Fig.1 Specificity of the multiplex PCR assay

注：(M)100 bp DNA ladder；(1～6)質量分別為10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg。圖2 多重PCR敏感性Note.(M)100 bp DNA ladder;(1～6)The quantity was of 10 ng,1 ng,100 pg,10 pg,1 pg, and 100 fg, respectively.Fig.2 Sensitivity of the multiplex PCR assay

注：(M)100 bp DNA ladder；(1～6)質量分別為10 ng、1 ng、100pg、10 pg、1 pg、100 fg；(A)支氣管鮑特桿菌；(B)支原體；(C)多殺巴氏桿菌；(D)肺炎克雷伯桿菌。圖3 單重PCR敏感性Note.(M)100 bp DNA ladder;(1～6)The quantity was 10 ng,1 ng,100 pg,10 pg,1 pg, and 100 fg,respectively；(A)Bordetella bronchiseptica；(B)Mycoplasma pneumoniae；(C)Pasteurella multocida；(D)Klebsiella pneumoniae.Fig.3 Sensitivity of the single PCR assay

2.3 應用

使用多重PCR方法對人工感染的氣管及分泌物DNA樣本進行擴增，結果顯示與預期結果一致，并無非特異性產物擴增(見圖4)；用多重PCR體系對收集的45份動物氣管及分泌物和鼻棉拭子DNA檢測，結果顯示9只小鼠同時擴增出多殺巴氏桿菌和肺支原體陽性的目的條帶，1只小鼠和5只兔擴增出多殺巴氏桿菌陽性的目的條帶(見圖5)。

注：(M)100 bp DNA ladder；(1)陽性對照;(2)陰性對照；(3)加多殺巴氏桿菌；(4)加支氣管鮑特桿菌；(5)加支原體；(6)加肺炎克雷伯桿菌；(7)加多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌。圖4 多重PCR的人工感染標本檢測結果Note.(M)100 bp DNA ladder;(1)Positive control；(2)Negative control；(3)Pasteurella multocida；(4)Bordetella bronchiseptica；(5)Mycoplasma pneumoniae；(6)Klebsiella pneumoniae；(7)The four bacteria.Fig.4 Results of the multiplex PCR detection of artificial positive samples

3 討論

多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌屬我國實驗動物必須排除的病原微生物。目前我國以上四種病原微生物的檢測仍采用國家標準推薦的傳統的分離培養方法和生化鑒定。該方法經典、準確，但操作繁瑣，費時，實驗條件限定和檢測人員的主觀判定使得該方法各檢測室之間易出現結果的差異。因此急需建立一種快速、準確的新檢測方法。

本研究在參考前人單重PCR研究的基礎上[5-7]，參照GenBank中多殺巴氏桿菌(KMT1)、支氣管鮑特桿菌(Fla)、支原體(16S rRNA)和肺炎克雷伯桿菌(phoE)的基因序列，在其高度保守區設計一對特異性引物，建立多重PCR體系。通過對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌的擴增表明，本實驗建立的PCR檢測方法特異性強；敏感性實驗中肺炎克雷伯桿菌DNA最低檢測質量均為10 pg，其他三種DNA最低檢測質量均為1 pg，多重PCR與單重PCR的敏感性結果一致，結果表明該多重PCR方法具有很高的敏感性，多重PCR不會影響其單重的敏感性。

注：(M)100 bp DNA ladder；(1)陽性對照;(2)陰性對照；(3～12)小鼠氣管分泌物和鼻棉拭子樣本;(13～17)兔氣管分泌物和鼻棉拭子樣本。圖5 多重PCR氣管及分泌物樣本檢測結果Note.(M)100 bp DNA ladder;(1)Positive control；(2)Negative control；(3～12)Tracheal secretion and cotton swab samples of mice；(13～17)Tracheal secretion and cotton swab samples of rabbits.Fig.5 Results of the multiplex PCR detection of tracheal secretion and cotton swab samples

考慮到樣本DNA提取物可能影響多重PCR反應特異性，本研究將多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌分別混入到動物氣管及分泌物中，提取總DNA，多重PCR方法擴增結果與預期結果一致，能夠準確的檢測摻入的病原微生物，甚至是四種全部，并且沒有非特異性擴增。為了驗證本方法在實際實驗動物病原菌檢測中的應用性，收集河北省實驗動物中心和山西省實驗動物中心20只小鼠，5只大鼠，10只兔，5只豚鼠，5只地鼠，共45只實驗動物的氣管及分泌物和鼻棉拭子，提取總DNA，使用多重PCR方法檢測四種病原微生物，同時根據國家標準的傳統方法和血清學方法做對比，結果顯示45份樣本中顯示9只小鼠同時擴增出多殺巴氏桿菌和肺支原體陽性的目的條帶， 1只小鼠和5只兔擴增出多殺巴氏桿菌陽性的目的條帶，但傳統方法和血清學方法并未檢測出陽性結果，45份樣本中多重PCR方法優于傳統和血清學方法，初步驗證本方法的可行性。本文建立的多重PCR方法旨在呼吸系統疾病的檢測，便于對實驗動物進行長期的微生物監測，達到質量控制標準。該多重PCR方法適用于實驗動物的微生物學檢測，可初步應用于無創呼吸系統疾病、墊料、常規的病原檢測和籠具環境的檢測。鼻棉拭子取材簡便，利于實驗動物微生物學檢測的大面積的篩查。下面的工作，將進一步擴大檢測樣本量驗證本方法的準確性和實用性。本方法有良好的重復性，操作簡單、快速，成本較低，可以在實驗動物微生物檢測中進一步應用。

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(1.河北省實驗動物重點實驗室，河北醫科大學實驗動物學部，石家莊 050000； 2.柏鄉縣中心醫院， 石家莊 050000； 3.河北醫科大學第四醫院，石家莊 050000)

目的 建立快速檢測多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌4種實驗動物病原體的多重PCR方法。方法 根據GenBank基因設計出特異性引物；經過多重PCR的優化，特異性和敏感性的檢測，建立多重PCR體系。應用該PCR體系檢測人工感染樣本和實驗動物的氣管分泌物，并與傳統方法做對比。結果 多重PCR擴增出多殺巴氏桿菌(356 bp)、支氣管鮑特桿菌(237 bp)、支原體(266 bp)和肺炎克雷伯桿菌(142 bp)的目的條帶。肺炎克雷伯桿菌敏感性為10 pg，多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體敏感性為1 pg，特異性檢測未從其他病原菌中檢測出目的條帶。應用建立的多重PCR體系檢測人工感染樣本的不同組合，45只實驗動物氣管檢測出15只多殺巴氏桿菌陽性，9只肺支原體陽性，但傳統培養方法和血清學方法未檢測出陽性標本。結論 本文建立的多重PCR方法操作簡單、快速、特異性強、靈敏度高，能夠實現對多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌4種實驗動物病原體的快速檢測。

多殺巴氏桿菌；支氣管鮑特桿菌；支原體；肺炎克雷伯桿菌；多重PCR

Establishment and application of a multiplex PCR assay for four pathogens in laboratory animals

ZHU Yan-bo1， XU Zeng-nian1， WEI Shi-jin2， ZHENG Long1， YOU Hong-yu1， MENG Yu-rong1， LIU Fu-ying1， LIANG Xiao-liang3， WANG Jun-xia1*
(1.Key Laboratory of Laboratory Animals, Hebei province, Department of Laboratory Animals, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China; 2. Baixiang County Central Hospital, Shijiazhuang 050000; 3.Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000)

Objective The aim of this study is to establish a multiplex polymerase chain raction (PCR) to identify of four kinds of laboratory animal pathogens:Pasteurellamultocida,Bordetellabronchiseptica,MycoplasmapneumoniaeandKlebsiellapneumoniae. Methods Specific primers were designed based on GenBank data. The multiplex PCR system was established through optimization of multiple PCR and detection of its specificity and sensitivity. This technique was used to test artificially infected samples and tracheal secretions of experimental animals (rat, mouse, guinea pig, rabbit, hamster), and comparing the detection results by this method and traditional detection test. Results Target bands ofPasteurellamultocida(356 bp),Bordetellabronchiseptica(237 bp),Mycoplasmapneumoniae(266 bp), andKlebsiellapneumoniae(142 bp) were obtained, with a detection sensitivity ofKlebsiellapneumoniaeof 10 pg, and that of Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica and Mycoplasma pneumoniae of 1 pg by this newly developed multiplex PCR assay. No target bands were observed from the non-specific pathogens of artificially infected samples. The tracheal secretions taken from 45 experimental animals (mice and rabbits) were tested with this new PCR assay, among which 15 cases ofKlebsiellapneumoniaand 9 cases ofPasteurellamultocidawere detected as positive, while all the results of traditional method and serological test were negative. Conclusions A simple, rapid, specific and highly sensitive multiplex PCR system has been successfully established.It is valuable for detection ofPasteurellamultocida,Bordetellabronchiseptica,Mycoplasmapneumoniae,andKlebsiellapneumoniaein laboratory animals.

Pasteurellamultocida;Bordetellabronchiseptica;Mycoplasmapneumoniae;Klebsiellapneumonia; Multiplex PCR

國家科技支撐計劃(2015BAI07B02-05)。

祝巖波(1990-)，女，碩士研究生，專業：動物學。E-mail:787211186@qq.com

王俊霞(1962-)，女，教授，研究方向：從事微生物檢驗。E-mail:13333011022@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0080-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.016

2016-11-28