腹壁撤退反射實驗測量方法概述

陳 穎，趙 妍，羅丹妮，黃 辰，周思遠

研究進展

腹壁撤退反射實驗測量方法概述

陳 穎，趙 妍，羅丹妮，黃 辰，周思遠*

內臟高敏感是功能性消化不良、腸易激綜合征、功能性腹痛等功能性胃腸病的重要發病原因之一，在上述疾病動物模型的評價中，是否存在內臟高敏感，是判斷模型成功的關鍵。目前應用最廣的評價動物內臟敏感性的方法為腹壁撤退反射實驗[1]，該方法通過擴張腸道，觀察動物的行為學反應來進行評價，操作簡單易行，對模型動物傷害較小，不易對后繼的研究造成影響[2]。然而，在目前AWR實驗的實際操作中，測量方法存在標準不統一，操作過程中的多種因素均可影響到實驗結果，可能導致對實驗動物內臟敏感性的評價有誤，從而影響以內臟高敏感為特點的動物疾病模型評估。因此本文對AWR的測量方法進行整理與分析，現綜述如下：

1 AWR操作的基本步驟

現有文獻中，AWR實驗的操作步驟大致如下：大鼠實驗前12 h[2-4]或18 h[6,7]或24 h[8,9]內禁食不禁水，實驗前用少量乙醚麻醉大鼠，把固定在導管一端的氣囊經石蠟油潤滑后，經大鼠肛門插入一定深度，用膠布把導管和大鼠尾巴根部纏在一起，以固定氣囊。將大鼠放在不能轉身的透明塑料籠內，待其適應至完全平靜后，緩慢向氣囊內注水或注氣以擴張腸道，分別觀察不同壓力值下腹部回縮反射，每次擴張持續一定時間，對每一壓力值進行重復測量，同時給予評分，以得分高低判斷內臟敏感性程度。

2 不同測量方法之間的差異

2.1 擴張方式

實驗中常用的直腸擴張方式包括血壓計注氣、注射器注氣、注射器注水三種，以血壓計注氣最為常見。血壓計注氣的方式是按血壓計每10 mmHg[22,27]或5 mmHg[12,30,32]上升的速度注入空氣，這常在20,40,60,80 mmHg四個等級強度[7,10,11,13,14,16,18-20,28]的壓力下分別觀察動物的行為學反應。注射器注氣可以將壓力表、注射器和導管分別經三通管連接，由注射器注入空氣，多在20,40,60,80 mmHg[15,17,22,34]的壓力下展開觀察。另一種方法則采用注射器直接注入空氣，并在各體積下分別觀察動物的行為學反應。注射器注水的方式多按0.2,0.4,0.6,0.8,1.2 mL[23,29]的規格依次緩慢注入生理鹽水[4,23]或26℃～28℃[4]溫水。

2.2 氣囊種類與制作方法

目前AWR實驗中使用的氣囊包括三類：橡膠指套、氣球和球囊。橡膠指套使用率最高，多采用外科醫用手套中號，選用中指段[1,3,13,14,28,30,33]。氣球多選用橡膠氣球[11-13,32]和硅油氣球[8]。以上兩種方法制作時用直尺在4.5 cm及6 cm處劃線標記，從6 cm處剪斷，用4號手術絲線在4.5 cm標記處與導管扎緊[2,3]，并用膠布加固，然后經注氣檢測，扎口處無漏氣即可。球囊則多使用血管擴張球囊。

2.3 各實驗結果出現明顯差異時，所對應的壓力值

通過對各實驗模型組與正常組的評價結果進行整理，我們發現：不同的實驗在同一擴張方式下，內臟敏感性出現明顯差異時，所對應的壓力值并不是相同的。如：經血壓計注入空氣時，大部分實驗在40、60 mmHg[11,13,33]或20、40、60、80 mmHg[16,19,30]的壓力下，實驗結果出現明顯差異；若注射器、血壓計通過三通管連接，差異明顯的實驗結果所對應的壓力值多為20、40、60、80 mmHg[18]。經注射器直接注入空氣的方式，其評價結果在0.4 mL的壓力下表現出明顯差異[8]；而經注射器注水的實驗，其結果多在0.8、1.2 mL[23]或0.2～1.0 mL[31]壓力下表現出明顯差異。

2.4 判斷標準

目前，常用的判斷標準包括：腹部收縮[12,13,22,28,32]、AWR等級評分[1,5,7,10,11,14,18,21,31,33-36]和AWR 3分閾值[2,3,9,24-27,37-39]。腹部收縮是以大鼠腹部出現收縮時，所對應的壓力或容量值為評價結果。AWR等級評分的評分標準為：0分，給予結直腸擴張刺激時大鼠無行為學反應；1分，給予刺激時變得不穩定，偶爾扭動頭部；2分，腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面；3分，腹背部肌肉較強烈收縮并把腹部抬離地面；4分，腹部肌肉強烈收縮，腹部呈弓形并把腹部、會陰部抬離地面。為減少誤差，取相同壓力下重復評分的平均值作為該壓力下的評分值。另外，AWR 3分閾值是以大鼠腹部抬起和背部拱起為評價標準，用以評估大鼠內臟敏感性的壓力或容量閾值。實驗中為減少誤差，不管采用何種測量方法，都多取重復測量的平均值作為最終判斷標準。

2.5 其他因素

該實驗使用導管以導尿管[1-5,8,9,25-27]為主，其余常用聚乙烯管[6,13-15,28,30,33]。導管直徑多數為2.7 mm[5,38]，或直接使用8F導尿管[2-4,9,26,27]。氣囊插入大鼠肛門的深度以6～8 cm[2,13,28,29,33,34]]居多，2 cm[18,31]次之。在每個相同壓力值下進行擴張的持續時間，絕大多數實驗為20 s[10,11,13,14,16-20]，其次為30 s[7,8,26,30-32]。每個相同壓力值的重復次數在絕大多數AWR實驗中，均為3次[2-6,9,10,34-38]。每次擴張的間隔時間，大部分實驗為4 min[19,22,30-33]，其次為5 min[2,3,12,16,20]。而氣囊插入大鼠肛門后，大鼠在容器里適應至完全平靜的時間，在絕大多數實驗中為30 min[1,5,30-33,37]。此外，對盲觀察者的設置有具體說明的文獻和對其未提及的文獻數目相當。其中盲觀察者人數設置少的為2人[2,6,19,32]，最多達3人[16]，其余文獻對具體數目均未作說明[3,8,12-15,33]。

3 討論

是否存在內臟高敏感，是判斷功能性消化不良、腸易激綜合征、功能性腹痛等功能性胃腸病動物模型成功的關鍵。腹壁撤退反射評價，是目前應用最廣的評價動物內臟敏感性的方法，是一種包括多因素在內的綜合操作方法，但目前鮮有較為公認的測量細節，缺少統一的測量標準，導致AWR實驗操作不規范，進而影響內臟敏感性評價結果的準確性。

從文獻回顧的情況看，目前常用的擴張方法有以下三種：血壓計注氣、注射器注水、注射器注氣。其中使用最多的是用血壓計注入空氣，該方法的優點體現在：1.操作簡便易行，方便實驗者更直觀地觀察壓力值，當操作過程中發生漏氣時能迅速被觀察者察覺；2.氣囊內壓力易排盡，避免了氣囊內氣體對下一次測量的干擾。該方法的缺點在于壓力的變化受氣囊材質和形狀的影響較大。經注射器注水和經注射器注入空氣的擴張方式，兩者的優點均在于可等體積注入壓力。而注水法的缺點在于每次擴張結束時，氣囊內的水無法排盡，可能引起對下一次測量結果的干擾。注氣法的缺點是漏氣后無法直觀發現，不易察覺。

而在同一擴張方式下，實驗結果出現明顯差異時，不同實驗者觀察到的壓力值并不相同。這種不同可能與AWR實驗整個操作過程中涉及到的多個因素密切相關。結合文獻與既往實驗研究，推測有以下幾個主要因素對不同實驗結果產生了干擾。

第一：氣囊的材質和形狀。使用球囊時，實驗結果多在20、40、60、80 mmHg時表現出明顯差異[3,16,18]；使用橡膠氣球、橡膠外科醫用手套時，實驗結果多在40、60 mmHg時表現出明顯差異[11,13,19,33]；而使用硅油氣球時，該值為0.4 mL[8]。在以上四種氣囊中，球囊是聚乙烯材質，而橡膠氣球、橡膠外科醫用手套、硅油氣球均為橡膠材質，但三者的形狀與厚度均有差異。橡膠材料力學性質復雜，胡斌等[40]發現在線性應變階段，氣球內部的壓強會隨著氣球體積的增大而上升，但當壓強達到其峰值后，氣球內部的壓強反而會隨著氣球體積的增大而減小。因此不同材質氣球的壓強，并不都是隨著注入氣體的增多而相應增大。不同材質的氣球之間，隨注入的氣體量而產生的壓強變化存在著較大差異，故對AWR實驗結果造成的影響也不同。在直結腸擴張中，氣囊可能作為主要工具，對整個實驗的結果造成主要的影響，基于此，本團隊將在后續的研究中對不同材質和形狀的氣囊進行實驗對比驗證，從中篩選出最適合作為氣囊的原料。

第二：插入的深度。氣囊插入肛門的深度不同，所刺激的腸道部位也不同。當插入2 cm深時，刺激部位為直腸；插入6～8 cm時，刺激的是降結腸和直腸。大多數實驗選擇的深度為6～8 cm，即刺激結直腸部位。有研究表明，功能性胃腸病患者的腸腔內環境，如碳水化合物吸收障礙導致的腔內高滲和高酸，可能改變結直腸傳入神經的興奮性和相對比例，從而誘發結直腸對擴張的高敏感[41]。故在AWR實驗中，刺激結直腸部位比刺激直腸部位對擴張更敏感，故選取6～8 cm更具科學性和可操作性。

第三：判斷標準。以腹部收縮為標準的評價方式，簡單直觀，但易受大鼠呼吸及排泄等生理反應的影響，產生的結果存在主觀偏倚。采用AWR等級評分作為判斷標準，要求實驗者熟練掌握并能準確辨別出0～4分所對應的行為學反應，操作過程不但耗時，且反復測量易對大鼠結直腸造成傷害。AWR 3分閾值，是近年來很多學者為了避免主觀誤差，在傳統的AWR評價方法上進行的改良：僅以直腸擴張時大鼠腹部抬高和背部拱起這兩種比較明顯的行為特征為標準，評估大鼠的容量閾值[1,39]，該標準操作步驟簡潔，標準單一。

此外，每次擴張的持續時間、重復次數、每次擴張之間的間隔時間以及氣囊插入肛門后，大鼠在容器內適應至完全平靜的時間，是決定大鼠進行每次擴張時，是否處于完全平靜狀態的關鍵。若擴張時間過長，重復次數過多，間隔時間過短，則會造成大鼠恢復至平靜的時間越長，同時對大鼠造成不同程度的損傷；若擴張時間過短，重復次數過少，則不能全面準確地觀察大鼠的實際反應狀態，以上情況均會導致實驗結果不準確。故找到以上因素起作用的最小臨界點，既可以避免由于大鼠狀態未歸于平靜的干擾，又可以節約實驗的操作時間，提高實驗效率。在實驗過程中若設置有盲觀察者，可減少主觀偏倚，使實驗結果更為客觀真實有說服力，增加了實驗設計的科學性與嚴謹性。

4 小結

綜上所述，建議對AWR實驗的操作方法為：大鼠實驗前12～24 h內禁食不禁水，開始操作前用少量乙醚麻醉大鼠，將固定在8F導尿管一端的圓形橡膠氣球經石蠟油潤滑后，經大鼠肛門插入4.5 cm深，用膠布把導管和大鼠尾巴根部纏在一起，以固定氣囊。將大鼠放在不能轉身的透明塑料籠內，待其適應至平靜后，經血壓計按10 mmHg的速度勻速加壓觀察3分閾值時對應的壓力值。重復擴張3次，每次擴張持續20 s，取平均值作為評分值。此外，在實驗過程中操作者與評價者應互相隔離，互不干擾，以減少主觀偏倚。對該方法的驗證將在今后的實驗中進一步深入闡釋，以期推動AWR實驗的標準化研究，形成規范的統一標準。

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(成都中醫藥大學針灸推拿學院，成都 610075)

腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex, AWR)實驗，通過擴張腸道來評價動物的行為學反應，是目前應用最廣的評價動物內臟敏感性的方法。然而，AWR實驗操作涉及因素多，目前鮮有較為公認的操作規程。本文通過對涉及AWR實驗測量方法的文獻進行梳理，歸納出AWR操作的基本步驟，總結不同測量方法在擴張方式、氣囊種類等相關因素方面的差異，并對相關因素的具體操作提出建議，以期為后續使用該方法評價動物內臟敏感性的研究者提供選擇方法，為實驗操作的標準化方案制定奠定必要基礎。

腹壁撤退反射實驗；測量方法；標準化

A summary of measurement methods for abdominal withdrawal reflex test

CHEN Ying， ZHAO Yan， LUO Dan-ni， HUANG Chen， ZHOU Si-yuan*
(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China)

Abdominal withdrawal reflex (AWR) test, which evaluates the behavioral response of animals through expanding the intestinal tract, is the most widely used method to assess animal’s visceral sensitivity in recent years. However, as AWR experimental operation involves many factors, it’s hard to find a commonly recognized operating procedure. Through review of literature of AWR experimental measuring methods, this article summarizes the basic steps of AWR operation. Meanwhile, it scrutinizes the differences of various measuring methods in relevant factors, including expansion method and airbag method, with special operating suggestions to them. Hopefully, this article will provide an option to future researchers who will use this method to evaluate animal’s visceral sensitivity, and provide a necessary foundation for the standardization of the experimental operation.

Abdominal withdrawal reflex test; Measurement methods; Standardization

國家自然科學基金(81503665)。

陳穎(1991-)，女，碩士生。研究方向：循證醫學與針灸臨床療效與評價。E-mail: 343047239@qq.com

周思遠(1984-)，女，講師，博士生。研究方向：針灸治療消化系統疾病的效應與機制研究。E-mail: zzsy6688@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0089-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.018

2016-11-24