認知障礙患者血漿集落刺激因子、炎性因子分析

張曦濛，蔡曉瑩，方燕南

(1.蘇州大學附屬第一醫院 神經內科， 江蘇 蘇州 215000；2.中山大學附屬第一醫院 神經內科，廣東 廣州 510080)

·論著·

認知障礙患者血漿集落刺激因子、炎性因子分析

張曦濛1，蔡曉瑩2，方燕南2

(1.蘇州大學附屬第一醫院 神經內科， 江蘇 蘇州 215000；2.中山大學附屬第一醫院 神經內科，廣東 廣州 510080)

目的 通過檢測阿茲海默病(AD)和血管性癡呆(VaD)患者血漿中粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)及部分炎性因子、β樣淀粉蛋白(Aβ)濃度并分析其相互關系，探討這些因子在AD和VaD的發病中的作用，并為二者的診斷治療提供新的靶點。方法 收集AD患者24例，VaD患者17例，健康對照32例。收集受試者基本信息，臨床資料及血液標本，用芯片法測定血漿G-CSF、M-CSF、白細胞介素(IL)-4、IL-5、IL-6、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-16、IL-17，Aβ40， Aβ42濃度。對比各組間各個因子的差異并分析其相關性。結果 AD組血漿G-CSF，M-CSF，IL-4，IL-5，IL-6，IL-12p40，IL-12p70，IL-15，IL-16濃度低于對照組(P<0.05)。VaD組M-CSF，IL-4低于對照組(P<0.05)。AD組及VaD組患者血漿Aβ42水平高于對照組(P<0.05)，Aβ40在各組間差異無統計學意義。各因子在AD和VaD組間差異無統計學意義。結論 免疫衰老可能為AD 的發病機制，血管性因素在VaD的發病中至關重要。G-CSF可作為AD和VaD鑒別的標識，也可作為治療AD的潛在靶點。

阿爾茨海默病；癡呆， 血管性；集落刺激因子；炎性因子

隨著人口老齡化的進展，癡呆成為社會突出問題。預計2020年癡呆患者將達到4億2千萬人，2040年將達到8億1千萬人[1]，這將給社會、家庭帶來沉重的負擔。全球范圍內，引起癡呆最常見的病因為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)和血管性癡呆(Vascular dementia，VaD)[2]。據統計，2010年我國的老年人群癡呆發病率約為3%，AD發病率為1.9%，VaD發病率為0.9%[3]。

目前認為，AD是一種以淀粉樣蛋白斑、神經纖維纏結、大量神經元丟失為特征的變性疾病，而VaD是以缺血缺氧性或出血性腦疾病造成的病理組織學損傷和進行性智能減退為特征。二者的發病機制有眾多假說但仍不明確。炎性機制是近年來的研究熱點，有不少研究指出，各種炎性因子介導的炎癥以及β樣淀粉蛋白(Aβ)的沉積、tau蛋白的磷酸化促進了認知障礙的發展。有動物實驗發現，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)有抑制炎癥、保護神經、減少Aβ沉積、促進神經細胞新生的作用，可改善AD小鼠的認知功能[4-6]。而這一結論并未得到人體相關試驗的證實，部分研究發現，認知功能障礙患者血液中炎性因子升高[7]，也有研究指出，炎性因子在AD患者體內是降低的。

本研究將通過檢測患者血漿中G-CSF、M-CSF及炎性因子、Aβ濃度并分析其相互關系，進一步探討這些因子在AD和VaD的發病中的作用，并為AD和VaD的診斷治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2015年3月1日至2015年11月31日于中山大學附屬第一醫院門診收集臨床診斷為AD、VaD的患者及健康對照。所有數據及樣本收集均征得患者及家屬同意，簽署知情同意書，若為嚴重認知障礙患者，則由其家屬代為簽署，研究經過中山大學附屬第一醫院倫理委員會審批。

1.2 納入標準 (1)AD組：①年齡50～85歲，符合NINCDS-ADRDA標準診斷為“很可能的阿爾茨海默病”；②簡易智力狀態檢查表(MMSE)評分顯示認知功能障礙(文盲組≤17分，小學組≤20分，中學或以上組≤24分)；③頭顱磁共振顯示腦萎縮，顳葉及海馬萎縮，無明顯腦白質損傷及腔隙性梗死，排除其他腦器質性病變；④Hachinski缺血指數量表<4分。(2)VaD組：①年齡50～85歲，符合DSM-IV-TR診斷血管性癡呆標準；②MMSE評分顯示認知功能障礙(文盲組≤17分，小學組≤20分，中學或以上組≤24分)，如為腦血管事件后認知功能下降，至少為發病后1年以上者，并且認知功能下降持續超過3個月；③頭顱磁共振提示腦白質變性(Fazekas評分>2)或有軟化灶；④Hachinski缺血指數量表>7分。(3)對照組：年齡50～85歲，但沒有認知障礙及腦血管事件發生，頭顱磁共振無明顯異常，無控制不佳的重大疾病。

1.3 排除標準 ①因其他原因引起的癡呆，如路易體癡呆、額顳葉癡呆、Pick病、腦積水、顱內腫瘤、舞蹈病、腦外傷、酒精及藥物引起的癡呆，及繼發于其他內科或神經科疾病如甲狀腺功能減退、惡性貧血、葉酸缺乏的癡呆等。②嚴重的控制不佳的基礎病，及炎癥性疾病，如肝炎、腫瘤、心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。

1.4 資料收集 詳細記錄患者的臨床資料，包括年齡，性別，文化程度，認知障礙的特點及發病時間，既往病史，吸煙飲酒史，家族史，輔助檢查如頭顱磁共振等，并完成MMSE量表測評。

1.5 樣本收集及檢測 所有血漿標本均在14:30～17:30收集完成，抽取血液2～4 ml于枸櫞酸鈉抗凝管內，常溫靜置3小時后于4 ℃，3 000 g，取上清液于-80 ℃保存至檢測。使用RayBiotec公司人炎癥因子抗體芯片3(貨號AAH-INF-G3)測定以下因子濃度：G-CSF，M-CSF，白細胞介素(IL)-4，IL-5，IL-6，IL-12p40，IL-12p70，IL-15，IL-16，IL-17，Aβ40，Aβ42。所使用的儀器包括塑料離心管(2～5 ml，50 ml)、搖床、塑料保鮮膜、雙蒸餾水、Genepix熒光掃描儀、Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板機。每個樣本測4次，取平均值作為最后結果。

2 結 果

2.1 基本信息 AD組24例，VaD組17例，對照組32例，共73例。各組在年齡、性別、發病時間、吸煙、飲酒、糖尿病、冠心病、腫瘤患病率差異無統計學意義。VaD組高血壓(P=0.000)、腦卒中(P=0.041)患病率高于對照組。VaD組高血壓(P=0.012)患病率高于對照組，AD組和VaD組各基線信息差異無統計學意義。見表1。

2.2 各因子比較 ①G-CSF及M-CSF：AD組的G-CSF值低于對照組(P=0.002)，VaD組的G-CSF值高于對照組(P=0.014)，AD組和VaD組間差異無統計學意義。AD組(P=0.000)、VaD組(P=0.001)M-CSF值均低于對照組，AD組和VaD組間差異無統計學意義。②其他炎性因子及Aβ：AD組IL-4(P=0.001)，IL-5(P=0.012)，IL-6(P=0.004)，IL-12p40(P=0.007)，IL-12p70(P=0.015)，IL-15(P=0.025)，IL-16(P=0.010)低于對照組。VaD組IL-4低于對照組(P=0.007)。AD組和VaD組間各炎性因子濃度差異無統計學意義。AD組(P=0.025)及VaD組(P=0.032)患者血漿Aβ42水平高于對照組，AD組和VaD組間Aβ42差異無統計學意義。Aβ40在各組間差異無統計學意義。見表2。

表1 3組基線信息比較

表2 3組炎性因子比較

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3 G-CSF、M-CSF和其他因素的相關性分析 G-CSF和M-CSF與年齡、發病時間及Aβ40無顯著相關，而和其余炎性因子均呈正相關，G-CSF和Aβ42呈負相關。見表3。

表3 G-CSF、M-CSF和其他因素及炎性因子的相關性

注：在P<0.05的前提下：弱正相關(0.1

3 討 論

很多研究支持認知障礙患者的大腦處于慢性炎癥狀態，導致老年斑、Aβ沉積、缺血的發生，最終損傷神經元[8-9]。但是炎癥因子在AD和VaD中具體發揮怎樣的作用仍不明確，各種因子很多時候既表現出神經損傷的功能，也表現出神經保護的功能。中樞神經系統和外周有很多炎性因子交通的渠道，已證實外周血中的炎性因子和中樞神經系統內的炎性因子有一定關聯[10]。

有研究發現AD患者中不論是前炎性因子還是抗炎因子都顯著降低，提出AD的發生和免疫衰老(immunosenescence)有關[11]。隨著年齡的增長，免疫功能會逐漸減弱，老年人也因此更容易感染，對各種病原的應答能力也會降低[12]。免疫衰老的原因包括年齡相關的胸腺萎縮，骨髓造血能力減弱，外周抑制細胞功能增強，這些因素會降低固有免疫和獲得性免疫功能[13]。這與我們的研究結果相一致，IL-4和IL-5可抑制IL-1，IL-6，腫瘤壞死因子α(TNF-α)等前炎性因子[14-15]，在中樞神經系統中具有抗炎作用。IL-6，IL-12，IL-15，IL-16為前炎性因子，在炎癥反應中起到重要作用[16]。而在本研究中，抗炎因子和促炎因子在AD和VaD中均呈降低趨勢，并非此消彼長，而是整個免疫系統功能下降，免疫降低可能為認知障礙發生的重要原因。AD和VaD患者多為老年人，且隨著年齡的增長患病率明顯上升，免疫功能的下降會導致對Aβ或其他神經毒性物質清除能力障礙，無法抵抗外來破壞因素，因此免疫衰老也很可能為認知障礙發生的原因。

無論在腦脊液還是在血漿或血清中，各種因子均有上調、無明顯變化或下調的報道，研究結果的異質性非常大。這些差異常被歸為使用的檢測技術、試劑盒有差異，或是選擇的患者和對照組在年齡、種族、疾病階段等方面具有差異性。也有學者推測，炎性因子研究結果的異質性很可能不僅僅是實驗技術和入選患者的差異，認知障礙患者的免疫系統可能處于較大的波動狀態，因此得出不同的結果。

本研究中，G-CSF在AD患者血漿中降低的結果和以往文獻報道相符[17- 18]，但G-CSF和炎性因子均呈正相關關系，不支持G-CSF可以抑制炎癥、下調炎性因子的理論，而支持G-CSF可能有增強免疫系統功能，促進炎性因子活動的作用。有研究報道，對AD模型小鼠予G-CSF和SCF治療后可減少大腦中淀粉樣蛋白的含量[4- 5]，本研究結果G-CSF和Aβ42呈負相關可以支持這一點。本研究首次發現G-CSF在VaD患者血漿中升高，分析原因可能為腦缺血后，神經元壞死引起G-CSF升高，從而發揮促進神經元新生的作用。根據以上結果推斷，G-CSF可能為AD治療的潛在藥物。G-CSF也可作為鑒別AD和VaD的一個標識。

關于M-CSF在癡呆患者中的作用有兩種不同理論，一種認為M-CSF作為一種炎性介質在AD患者體內升高，促進炎癥導致AD的發生[19]；另一種認為M-CSF在AD患者體內降低，從而減弱小膠質細胞的增殖及吞噬功能，導致Aβ累積[20]。根據我們的結果，M-CSF和各炎性因子呈正相關，可佐證M-CSF有促進炎癥的功能。我們推測，M-CSF降低可減弱小膠質細胞吞噬功能，同時也減弱了小膠質細胞促進炎癥的功能，使得免疫功能下降，最終導致對神經元保護功能的減弱，Aβ的沉積，促進認知障礙的發展。因此M-CSF降低可能為AD及VaD發病的重要因素，M-CSF可能為治療AD及VaD的認知功能障礙的共同靶點。

在我們的研究中，VaD組炎性因子變化甚少，而通過患者的基線信息分析可得知，VaD患者高血壓、腦卒中、冠心病等血管性疾病的發病率顯著升高，通過防治心腦血管疾病，可有效預防VaD的發病。

免疫衰老可能為AD 的發病機制，血管性因素在VaD的發病中至關重要。G-CSF可作為AD和VaD鑒別的標識，也可作為治療AD的潛在靶點。

[1] Lambert MA， Bickel H， Prince M， et al. Estimating the burden of early onset dementia; systematic review of disease prevalence[J]. Eur J Neurol， 2014，21(4):563-569.

[2] 韋建武， 方達， 巨喜煥，等. 血管性癡呆與中風后非癡呆患者的腦mri對比研究[J]. 臨床薈萃， 2012，27(4): 322-323.

[3] Rizzi L， Rosset I，Roriz-Cruz M. Global epidemiology of dementia： alzheimer's and vascular types[J]. Biomed Res Int， 2014:908915.

[4] Zhao C， Xie Z， Wang P， et al. Granulocyte-colony stimulating factor protects memory impairment in the senescence-accelerated mouse (sam)-p10[J]. Neurol Res， 2011. 33(4): 354-359.

[5] Murphy GM Jr， Zhao F， Yang L， et al. Expression of macrophage colony-stimulating factor receptor is increased in the aβppv717f transgenic mouse model of alzheimer’s disease[J]. Am J Pathol， 2000， 157(3): 895-904.

[6] Schneider A， Krüger C， Steigleder T， et al. The hematopoietic factor g-csf is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drives neurogenesis[J]. J Clin Invest， 2005， 115(8): 2083-2098.

[7] 劉增玲， 李文， 李海龍，等. 血管性認知功能障礙非癡呆型患者外周血炎性標記物的臨床研究[J]. 中國臨床神經科學， 2013，21(1): 32-36.

[8] 鄔烈銘， 朱文芳， 裴瑜，等. 老年性癡呆患者認知功能與血清炎性細胞因子濃度的相關研究[J]. 中華臨床醫師雜志：電子版， 2012，6(11): 2970-2973.

[9] Minter MR， Taylor JM， Crack PJ. The contribution of neuroinflammation to amyloid toxicity in alzheimer's disease[J]. J Neurochem， 2016， 136(3): 457-474.

[10] Huberman M， Shalit F， Roth-Deri I， et al.Correlation of cytokine secretion by mononuclear cells of alzheimer patients and their disease stage[J]. J Neuroimmunol，1994，52(2): 147-152.

[11] Richartz E， Stransky E， Batra A， et al. Decline of immune responsiveness: A pathogenetic factor in alzheimer's disease [J]. J Psychiatr Res， 2005，39(5): 535-543.

[12] 王敏. 免疫衰老與固有免疫細胞的相關研究進展[J]. 基礎醫學與臨床， 2016，36(1): 125-129.

[13] Martorana A， Bulati M， Buffa S， et al. Immunosenescence， inflammation and alzheimer's disease[J]. Longev Healthspan， 2012， 1: 8.

[14] 張彤， 臺立穩， 趙桂森. 腦出血患者血清和顱內血腫液中白細胞介素4、白細胞介素6含量的研究[J]. 臨床薈萃， 2009，24(6): 478-480.

[15] Powrie F， Menon S， Coffman RL. Interleukin-4 and interleukin-10 synergize to inhibit cell-mediated immunity in vivo[J]. Eur J Immunol， 1993， 23(11): 3043-3049.

[16] Esmaeilzadeh M， Sadeghi M， Galmbacher R，et al. Time-course of plasma inflammatory mediators in a rat model of brain death[J]. Transpl Immunol， 2017， pii: S0966-3274(17)30094-1.

[17] Laske C， Stellos K， Stransky E， et al. Decreased plasma levels of granulocyte-colony stimulating factor (g-csf) in patients with early alzheimer's disease[J]. J Alzheimers Dis， 2009， 17(1): 115-123.

[18] Barber RC， Edwards MI， Xiao G，et al. Serum granulocyte colony-stimulating factor and alzheimer's disease[J]. Dement Geriatr Cogn Dis Extra， 2012， 2(1): 353-360.

[19] Laske C， Stransky E， Hoffmann N， et al. Macrophage colony-stimulating factor (m-csf) in plasma and csf of patients with mild cognitive impairment and alzheimer's disease[J]. Curr Alzheimer Res， 2010， 7(5): 409-414.

[20] Boissonneault V， Filali M， Lessard M， et al. Powerful beneficial effects of macrophage colony-stimulating factor on beta-amyloid deposition and cognitive impairment in alzheimer's disease[J]. Brain， 2009， 132(Pt 4): 1078-1092.

Analysis of plasma colony stimulating factors and inflammatory factors in patients with cognitive impairment

Zhang Ximeng1， Cai Xiaoying2， Fang Yannan2
1.DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215000，China;2.DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-SenUniverisity，Guangzhou510080，China

Objective Detect the concentration of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)， macrophage colony stimulating factor (M-CSF) 、some inflammatory factors and β-amyloid (Aβ) in plasma of patients with Alzheimer's Disease (AD) and vascular dementia (VaD). Analyze their relationship， explore the role of these factors in the pathogenesis of AD and VaD， and provide a new target for the diagnosis and treatment of both.Methods 24 AD patients， 17 VaD patients and 32 healthy controls were included. Basic information of them were collected. The concentration of plasma G-CSF， M-CSF， IL-4， IL-5， IL-6， IL-12p40， IL-12p70， IL-15， IL-16， IL-17， Aβ40， Aβ42 were measured by array. Results The concentrations of plasma G-CSF， M-CSF， IL-4， IL-5， IL-6， IL-12p40， IL-12p70， IL-15 and IL-16 in AD group were significantly lower than those in the control group. The concentrations of M-CSF and IL-4 in VaD group were significantly lower than those in control group. The levels of plasma Aβ42 in AD group and VaD group were significantly higher than those in control group. Each factor showed no significant difference between AD and VaD groups.Conclusion Immunosenescence may be the pathogenesis of AD. Vascular factors are important in the pathogenesis of VaD. G-CSF can be used in identification of AD and VaD， and also as a potential target for the treatment of AD.

alzheimer disease; vascular dementia; colony stimulating factor; inflammatory factor

方燕南，Email: yannanfang2012@qq.com

R745.7；749.16

A

1004-583X(2017)09-0774-04

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.09.010

2017-07-31 編輯:張衛國

Correspondingauther:FangYannan，Email:yannanfang2012@qq.com