高效液相色譜法測(cè)定云南小粒咖啡豆中咖啡因的含量

陳嫻+刁玉華+肖麗恒

摘 要：建立測(cè)定云南小粒咖啡豆中咖啡因含量的HPLC方法，采用高效液相色譜儀帶紫外檢測(cè)器，使用C18柱（粒徑：5 μm，3.9 mm×150 mm）；流動(dòng)相：甲醇+水（24+76）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器：檢測(cè)器波長(zhǎng)272 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量10 μL作為分析條件。咖啡因在0～200 ug/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；回收率均在90%～110%之間；檢出限為0.125 mg/kg。結(jié)論 該法具有準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合飲料中的咖啡因含量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：液相色譜法 測(cè)定 云南小粒咖啡豆 咖啡因

中圖分類號(hào)：O652.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2017）07（a）-0126-02

咖啡因：（Caffeine）是咖啡果中含有的一種生物堿，適度使用有祛除疲勞、興奮神經(jīng)的作用，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱和昏迷復(fù)蘇。但是，大劑量或長(zhǎng)期使用也會(huì)對(duì)人體造成損害，特別是它也有成癮性，一旦停用會(huì)出現(xiàn)精神萎頓、渾身困乏疲軟等各種戒斷癥狀，雖然其成癮性較弱，戒斷癥狀也不十分嚴(yán)重，但由于藥物的耐受性而導(dǎo)致用藥量不斷增加時(shí)，咖啡因就不僅作用于大腦皮層，還能直接興奮延髓，引起陣發(fā)性驚厥和骨骼震顫，損害肝、胃、腎等重要內(nèi)臟器官，誘發(fā)呼吸道炎癥、婦女乳腺瘤等疾病，甚至導(dǎo)致吸食者下一代智能低下，肢體畸形。因此也被列入受國(guó)家管制的精神藥品范圍。濫用咖啡因通常也有吸食和注射兩種形式，其興奮刺激作用及毒副反應(yīng)、癥狀、藥物依賴性與苯丙胺相近。咖啡因主要用于對(duì)抗中樞抑制狀態(tài)，如嚴(yán)重傳染病、鎮(zhèn)靜催眠藥過(guò)量引起的昏睡及呼吸循環(huán)抑制等，可肌肉注射苯甲酸鈉咖啡因。此外，咖啡因還常配伍麥角胺治療偏頭痛：配伍解熱鎮(zhèn)痛藥治療一般性頭痛[1]。此時(shí)，它由于收縮腦血管，減少腦血管搏動(dòng)的幅度而加強(qiáng)以上藥物止頭痛的作用。目前對(duì)于咖啡因測(cè)定的方法主要有：滴定法[2]、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)法[3]、高效液相色譜法[4]、氣相色譜法[5]、薄層色譜法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]等方法。文章采用高效液相色譜的方法測(cè)定咖啡因，建立了采用高效液相色譜的方法測(cè)定云南小粒咖啡豆中咖啡因的方法，試驗(yàn)表明該方法前處理簡(jiǎn)單，分離效能好，回收率高，可以快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)云南小粒咖啡豆中的咖啡因，得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

云南小粒咖啡豆（市售）；超純水；氧化鎂（MgO）；甲醇（CH3OH）：色譜純；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品（C8H10N4O2）：純度≥99%；編號(hào)：58-08-2；批號(hào)：200911；生產(chǎn)廠家：美國(guó)。

高效液相色譜儀（帶紫外檢測(cè)器，Agilent 1260美國(guó)安捷倫科技有限公司）；水浴鍋（HH-6常州國(guó)華有限公司）；電子天平（CP213美國(guó)，奧豪斯），感量為0.1 mg；超純水器（明澈UV24美國(guó)密理博公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

稱取1 g（精確至0.001 g）經(jīng)粉碎低于30目的均勻樣品于250 mL錐形瓶中，加入約200 mL水，沸水浴30 min，不時(shí)振搖，取出流水冷卻1 min，加入5 g氧化鎂，振搖，再放入沸水浴20 min，取出錐形瓶，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水定容至刻度（使樣品溶液中咖啡因含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)），搖勻，靜置，取上清液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2.0 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品0.002008 g（精確至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容。放置于4 ℃冰箱，有效期為6個(gè)月。

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)中間液（200 μg/mL）：準(zhǔn)確吸取5.0 mL咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中，用水定容。放置于4 ℃冰箱，有效期為一個(gè)月。咖啡因校準(zhǔn)曲線工作液：吸取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成濃度分別為10.0、20.0、40.0、80.0、100、120.0、160.0、200 μg/mL的工作液，臨用時(shí)配制。將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液經(jīng)液相色譜儀測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 儀器工作條件

色譜柱：C18柱（粒徑：5 μm，3.9 mm×150 mm）；流動(dòng)相：甲醇+水（24+76）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測(cè)器：檢測(cè)器波長(zhǎng)272 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 校準(zhǔn)曲線

取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，用高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=27.32252x+12.55479，r=0.99985（見(jiàn)表1），表明線性關(guān)系良好。

2.2 精密度試驗(yàn)

取咖啡因含量高、中、低3個(gè)濃度分別進(jìn)行6次測(cè)定，計(jì)算6次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，變異系數(shù)均小于15%（見(jiàn)表2），表明使用該方法測(cè)定咖啡因數(shù)據(jù)可靠。

2.3 檢出限

方法的測(cè)定限為信噪比（S/N）3∶1時(shí)的濃度，計(jì)算得到方法檢出限為：0.000 5 μg/mL，即：0.125 mg/kg。

定量限為信噪比（S/N）10∶1時(shí)的濃度為：0.42 mg/kg。標(biāo)樣色譜圖如圖1，樣品色譜圖。

2.4 回收率和誤差

精確稱取1.0 g云南小粒咖啡豆樣品，加入標(biāo)樣，濃度為20.28 μg/mL，進(jìn)行3次測(cè)定，經(jīng)測(cè)定后平均值117.634 4 mg/kg，誤差為3.6，回收率為97%（見(jiàn)表3）。偏差范圍小，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度較好。

3 結(jié)語(yǔ)

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用建立的高效液相色譜檢測(cè)方法測(cè)定云南小粒咖啡豆中的咖啡因，具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，且測(cè)量的范圍滿足標(biāo)準(zhǔn)限量的檢測(cè)要求。

參考文獻(xiàn)

[1] 董善士，王義明，林似蘭，等.維磷補(bǔ)汁中咖啡因的HPLC分析條件的單純形法優(yōu)化[J].中國(guó)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，1987， 18（3）：209.

[2] 張帆，賀學(xué)峰，汪學(xué)楷.高效液相色譜法測(cè)定飲料中食品添加劑的含量[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)：工程科學(xué)版，2000，34 （4）：56-58.

[3] 沈其元.高效液相色譜法測(cè)定飲料中的咖啡因[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2002，19（5）：329.

[4] 趙清嵐，楊靜，白冰，等.薄層掃描法同時(shí)測(cè)定綠茶中的EGCG、ECG和咖啡因[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，39（3）：256-258.

[5] Tasker R A R，Connell B J，Strain S M.Pharmacology of systematically administered domoic acid in mice[J].Can J Physiol pharmacol，1991，69（3）：378-382.

[6] Smith D S，Kitts D D.Enzyme Immunoassay for the determination of domoic acid in mussel extracts[J].J Agric Food.Chem，1995（43）：367-371.

[7] Garthwaite I，Ross K M，Miles C O，et al.Polyclonal antibodies to domoic acid and their use in immunoassays for domoic acid in seawater and shellfish[J].Nat Toxins，1998（6）：93-104.endprint