醒腦靜對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞線粒體損傷的保護作用

尚亞細亞 杜菊梅 張磊 申艷方 張文青 梁風俊

醒腦靜對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞線粒體損傷的保護作用

尚亞細亞 杜菊梅 張磊 申艷方 張文青 梁風俊

目的 觀察醒腦靜注射液對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞線粒體損傷的保護作用。方法 將培養的SH-SY5Y細胞隨機分為5組，即(1)正常對照組：細胞正常培養27 h；(2)AD細胞模型組：細胞正常培養3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25μmol/L)處理24 h；(3)醒腦靜低濃度組：醒腦靜注射液(5 μl/mL)預處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h；(4)醒腦靜中濃度組：醒腦靜注射液(10 μl/mL)預處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25μmol/L)處理24 h；(5)醒腦靜高濃度組：醒腦靜注射液(20 μl/mL)預處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h；處理后各組細胞利用MTT法檢測細胞存活率，紫外分光光度法檢測細胞內ATP含量，流式細胞儀檢測線粒體膜電位水平。結果 AD細胞模型組細胞存活率較正常對照組降低(P<0.05)，醒腦靜不同濃度組細胞存活率較AD細胞模型組均明顯升高(P<0.05)；AD細胞模型組細胞內ATP含量、線粒體膜電位水平較正常對照組下降(P<0.05)，醒腦靜不同濃度組細胞內ATP含量、線粒體膜電位水平較AD細胞模型組顯著升高(P<0.05)。結論 醒腦靜預處理可抑制Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，提高細胞存活率，其機制可能與醒腦靜提高細胞內ATP含量及線粒體膜電位水平而發揮線粒體保護作用有關。

醒腦靜 阿爾茨海默病 β淀粉樣蛋白 ATP 線粒體膜電位

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是老年人常見的神經系統變性疾病，也最常見的癡呆類型，臨床上主要表現為進行性記憶與認知功能減退。目前我國有AD患者600～800萬，其中65歲以上老年人AD患病率為3%～7%，隨著人口老年化社會的不斷加劇，AD防治形勢不容樂觀。目前AD具體發病機制尚不明確，β淀粉樣蛋白(amyloid beta, Aβ)沉積形成的老年斑及神經原纖維纏結形成是AD典型病理特征。研究表明Aβ可直接或間接對線粒體結構及功能造成損傷[1-3]，而線粒體損傷后一方面可誘發氧化應激、激活凋亡信號通路等級聯反應；另一方面可促進Aβ生成[4]，進一步加重線粒體損傷，從而形成惡性循環，導致神經元變性凋亡。因此，抑制Aβ誘導的線粒體損傷對減輕AD病理損害具有重要意義。

醒腦靜注射液是由傳統名方“安宮牛黃丸”經科學改制而成的水溶性中藥注射液，主要成分為麝香、郁金、冰片、梔子。研究顯示醒腦靜注射液可改善臨床AD患者MMSE、ADAS-cog、GDS評分[5]，但其具體機制尚不清楚。膿毒癥大鼠實驗發現醒腦靜注射液可減輕心肌線粒體腫脹、空泡樣改變，降低線粒體電鏡下的半定量評分，具有線粒體保護作用[6]。在AD患者中醒腦靜注射液是否可發揮線粒體保護作用、抑制神經元凋亡、改善認知障礙尚未明確。本研究利用AD細胞模型探討醒腦靜注射液對Aβ25-35誘導的線粒體損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SH-SY5Y細胞購自中國科學院上海細胞庫；高糖DMEM培養基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；0.25%胰酶(Trypsin公司)；Aβ25-35(Sigma公司)；噻唑藍MTT(Sigma公司)；ATP含量測試盒(南京建成生物工程研究所)；細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；醒腦靜注射液。

1.2 方法

1.2.1 Aβ25-35老化處理

用1.8 mL重蒸水將1 mg Aβ25-35溶解成濃度為500 μmol/L的母液，于37 ℃下孵育7 d以形成聚集形式的Aβ25-35，-20℃冷凍保存備測，測量前用培養基稀釋成實驗所需濃度。

1.2.2 細胞培養

SH-SY5Y細胞株接種于盛有DMEM完全培養基的培養瓶中，放置于37 ℃、5%的CO2培養箱中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每3～4 d傳代1次，傳代按1∶3進行，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.3 AD細胞模型制備

AD細胞模型制備參考Hongquan等方法[7]：用DMEM完全培養基將老化的Aβ25-35稀釋至25 μmol/L，將正常培養的SH-SY5Y細胞暴露于 Aβ25-35(25 μmol/L)中24 h，即制成所需AD細胞模型。

1.2.4 實驗分組

將培養的SH-SY5Y細胞隨機分為5組，即(1)正常對照組：細胞正常培養27 h；(2)AD細胞模型組：細胞正常培養3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h；(3)醒腦靜低濃度組：醒腦靜注射液(5 μl/mL)預處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h；(4)醒腦靜中濃度組：醒腦靜注射液(10 μl/mL)預處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h；(5)醒腦靜高濃度組：醒腦靜注射液(20 μl/mL)預處理細胞3 h，隨后用老化的Aβ25-35(25 μmol/L)處理24 h。

1.2.5 MTT法檢測細胞存活率

SH-SY5Y細胞接種于96孔培養板，按照實驗分組干預處理后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μL，37 ℃繼續孵育4 h，終止培養，移除孔內培養液，每孔加入150 μl DMSO，搖床上低速震蕩10 min使甲臜充分溶解，空白孔調零，酶標儀上490 nm波長處檢測各孔OD值，記錄并計算細胞存活率。

1.2.6 細胞ATP含量檢測

SH-SY5Y細胞接種于6孔培養板，按照實驗分組干預處理后嚴格按ATP含量測試盒說明書進行操作，利用紫外分光光度計檢測各孔吸光度值，記錄并計算ATP含量，ATP含量(μmol/L)=[(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)]×標準品含量×樣本測定前稀釋倍數÷待測樣本蛋白含量。

1.2.7 細胞線粒體膜電位檢測

利用JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位，將SH-SY5Y細胞接種于6孔培養板，按照實驗分組干預處理后嚴格按線粒體膜電位檢測試劑盒說明書操作，各組單細胞懸液用流式細胞儀檢測(Ex=488 nm；Em=530 nm)，綠色熒光通過FITC通道FL1檢測，紅色熒光通過PI通道FL2檢測，計算各組紅綠熒光強度比值。

1.2.8 統計學處理

2 結 果

2.1 各組細胞存活率

AD細胞模型組細胞存活率較正常對照組降低(P<0.05)；與AD細胞模型組比較，醒腦靜低濃度組、中濃度組及高濃度組細胞存活率明顯升高(P<0.05)；不同濃度醒腦靜組比較，醒腦靜低濃度組細胞存活率高于中濃度組、高濃度組(P<0.05)(表1)。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD細胞模型組比較，#P<0.05；與醒腦靜低濃度組比較，▲P<0.05

2.2 ATP含量檢測

與正常對照組比較，AD細胞模型組ATP含量顯著降低(P<0.05)；醒腦靜低濃度組、中濃度組及高濃度組ATP含量較AD細胞模型組升高(P<0.05)；不同濃度醒腦靜組比較，醒腦靜低濃度組ATP含量高于中濃度組、高濃度組(P<0.05)(表2)。

2.3 線粒體膜電位檢測

與正常對照組比較，AD細胞模型組線粒體膜電位明顯降低(P<0.05)；醒腦靜低濃度組、中濃度組及高濃度組線粒體膜電位較AD細胞模型組升高(P<0.05)；不同濃度醒腦靜組比較，醒腦靜低濃度組線粒體膜電位高于中濃度組、高濃度組(P<0.05)(圖1，表3)。

表2 各組細胞ATP含量檢測(μmol/L)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD細胞模型組比較，#P<0.05；與醒腦靜低濃度組比較，▲P<0.05

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞線粒體膜電位

表3 各組細胞線粒體膜電位檢測

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD細胞模型組比較，#P<0.05；與醒腦靜低濃度組比較，▲P<0.05

3 討 論

AD是老年人最常見的癡呆類型，雖然隨著國內外學者對AD研究的不斷深入，相繼提出了Aβ級聯假說、Tau蛋白過度磷酸化假說、氧化應激假說、膽堿能假說、興奮性氨基酸毒性假說等發病機制假說，但目前AD發病機制仍未完全闡明，亦無確切有效的治療方法。腦組織中Aβ異常沉積形成老年斑是AD典型病理特征之一，研究表明Aβ對神經元內線粒體具有顯著毒性作用，AD模型大鼠腦組織中靠近Aβ斑塊的神經元內線粒體數量減少、膜電位下降，并可見營養不良和破碎的線粒體[8]。利用電子顯微鏡觀察AD患者海馬、額葉皮層、小腦皮層、丘腦等部位的神經元，亦可見廣泛的線粒體腫脹、數量減少、嗜鋨物質聚集，嚴重者出現空泡變性和線粒體嵴斷裂[9]。線粒體損傷后可刺激APP經淀粉樣代謝途徑水解生成具有毒性作用的Aβ[4]，從而形成Aβ聚集→線粒體損害→Aβ生成的惡性循環，加重AD病理損害。因此，積極尋求線粒體保護劑來抑制Aβ誘導的線粒體損傷對緩解AD病理損害具有重要意義。

中醫學認為，神明失用是阿爾茨海默病發病的基本病理，心腎虛衰、痰瘀阻滯是導致神明失用的內在機制，治療當以開竅醒神、強記益智為施治總則。醒腦靜注射液是由《溫病條辨》傳統名方“安宮牛黃丸”經科學改制而成的水溶性中藥注射液，主要成分為麝香、郁金、冰片、梔子，四藥相配具有醒腦開竅、行痰通瘀、清解毒邪之功效。有研究發現醒腦靜注射液可明顯縮短AD模型大鼠在水迷宮試驗中的逃避潛伏期，增加跨越原平臺次數，減輕AD模型大鼠的學習記憶障礙[7]，改善臨床AD患者MMSE、ADAS-cog、GDS評分[5]，但其具體分子機制尚不清楚。在膿毒癥大鼠心肌損傷實驗中王金華等研究發現醒腦靜注射液可減輕膿毒癥大鼠心肌線粒體腫脹、空泡樣改變，降低線粒體電鏡下的半定量評分，對膿毒癥大鼠心肌線粒體發揮保護作用[6]。醒腦靜是否可通過線粒體保護作用來減輕Aβ細胞毒性、改善AD患者癡呆癥狀尚不清楚，本研究利用AD細胞模型探討醒腦靜注射液對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞線粒體損傷的保護作用。

線粒體是細胞內能量轉換的主要結構，被稱為“細胞動力工廠”。線粒體通過三羧酸循環、電子傳遞過程使H+經ATP酶復合體回流產生自由能，進而驅動ATP合酶將高能磷酸鍵轉移給ADP生成ATP。前期研究表明Aβ可引起線粒體ATP合成減少，其機制可能是Aβ結合ATP合酶的α亞單位后引起ATP合酶構象改變，從而阻礙了底物水平磷酸化產生的高能磷酸鍵轉移至ADP生成ATP[10]；也可能與Aβ誘導細胞氧化應激，降低細胞色素C氧化酶活性，抑制了線粒體電子傳遞和氧化磷酸化過程有關[11]。本研究發現，Aβ25-35可導致SH-SY5Y細胞ATP含量下降，而醒腦靜預處理可相對提高細胞內ATP含量，提示醒腦靜預處理可減輕Aβ25-35引起的SH-SY5Y細胞ATP合成障礙。ATP是細胞內能量儲存的主要形式，ATP高能磷酸鍵水解生成ADP所釋放的能量，可為細胞分裂增殖、離子轉運、信號傳導、神經元軸突運輸等生理活動提供動力支持，醒腦靜預處理提高AD模型細胞內ATP含量，有利于維持細胞正常新陳代謝、減少細胞凋亡。

線粒體是由流動的雙層單位膜套疊形成的封閉性膜囊結構，雙側單位膜分別稱為外膜和內膜，外膜可允許分子量10000以下的小分子物質自由通過，而內膜對物質的通透具有高度選擇性，是線粒體膜電位形成的基礎。線粒體膜電位下降是線粒體損傷和細胞凋亡的早期標志，研究發現Aβ干預海馬神經元8 h后神經元內線粒體膜電位下降、細胞凋亡增加，其機制可能與Aβ激活多聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)有關[12]。Rao等研究發現線粒體通透轉換孔(mPTP)開放在Aβ誘導的線粒體膜電位下降中也發揮作用，Aβ可與mPTP上的親環素-D相互作用，促進mPTP開放，引起線粒體膜電位下降[13]。本研究Aβ25-35干預SH-SY5Y細胞24 h后細胞線粒體膜電位顯著下降，與前期研究結果一致，而醒腦靜各組細胞線粒體膜電位較AD模型細胞明顯升高，提示醒腦靜預處理可減輕Aβ引起的線粒體膜電位下降，從而有利于維持線粒體膜正常通透性及線粒體內膜兩側電荷梯度，穩定細胞氧化呼吸及能量代謝。

線粒體膜電位下降是細胞凋亡的早期標志，醒腦靜可相對升高Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位，可能具有抗Aβ誘導的細胞凋亡作用。本研究利用MTT法檢測細胞存活率，結果發現醒腦靜各組細胞存活率較AD模型組細胞明顯升高，提示醒腦靜預處理可抑制Aβ誘導的細胞凋亡。有研究發現醒腦靜可通過下調Caspase-3水平來抑制腦外傷、腦出血后神經元凋亡[14-16]，醒腦靜的抗神經元凋亡作用可能與其調節Caspase-3活性有關，Caspase-3是Caspase依賴凋亡途徑的主要下游分子，線粒體損傷后線粒體膜電位下降、ATP含量減少，線粒體通透性增加，可導致線粒體內細胞色素C、內核酸酶G、凋亡誘導因子等凋亡相關蛋白釋放，活化Caspase-3，啟動Caspase依賴細胞凋亡[17]。本研究發現醒腦靜可提高Aβ25-35干預后SH-SY5Y細胞存活率，同時可提高線粒體膜電位、ATP含量，推測醒腦靜抗神經元凋亡作用可能與其減輕Aβ誘導的線粒體損傷，減少線粒體凋亡蛋白釋放有關，但其對線粒體的保護作用機制尚有待進一步研究。

綜上所述，本研究發現醒腦靜預處理可抑制Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，提高細胞存活率，其機制可能與醒腦靜提高細胞內ATP含量及線粒體膜電位水平，發揮線粒體保護作用有關，但其對線粒體的保護作用機制尚有待進一步研究。醒腦靜是臨床上廣泛用于腦血管病、腦外傷的治療，其安全性、有效性已獲得臨床認可，深入發掘醒腦靜在AD治療方面的潛在作用機制將有望為AD治療提供新的治療選擇。

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(2016-11-17收稿)

The protective effect of Xingnaojing on mitochondrial damage of SH-SY5Y cells induced by Aβ25-35proteins

ShangYaxiya,DuJumei*,ZhangLei,etal.

DepartmentofNeurology,TheSecondAffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712000

Objective To investigate the protective effect of Xingnaojing on mitochondrial damage of SH-SY5Y cells induced by Aβ25-35proteins.Methods SH-SY5Y cells were divided into 5 groups: (1) normal control group(cells were cultured for 27 h), (2) AD cell model group(after 3h in normal culture, cells were treated with 25 μM Aβ25-35for 24h), (3) Xingnaojing low concentration group( before treatment with 25 μM Aβ25-35for 24h, cells were pretreated with 5 μl/mL Xingnaojing for 3 h), (4) Xingnaojing middle concentration group(before treatment with 25μM Aβ25-35for 24 h, cells were pretreated with 10 μl/mL Xingnaojing for 3 h), (5) Xingnaojing high concentration group(before treatment with 25 μM Aβ25-35for 24 h, cells were pretreated with 20 μl/mL Xingnaojing for 3 h). After treatment, cell viability was measured by MTT conversion, levels of mitochondrial membrane potential and ATP contents were evaluated by flow cytometry and UV-Spectrophotometric method respectively.Results cell viability significantly decreased in AD cell model group compared with normal control group(P<0.05), Xingnaojing(5,10,20 μl/mL) pretreatment significantly elevated cell viability compared with AD cell model group(P<0.05). Exposure of SH-SY5Y cells to Aβ25-35for 24 h reduced mitochondrial membrane potential and ATP contents(P<0.05), compared with AD cell model group, Xingnaojing(5,10,20 μl/mL) pretreatment significantly elevated ATP content and mitochondrial membrane potential(P<0.05).Conclusion Xingnaojing pretreatment could inhibit apoptosis of SH-SY5Y cells induced by Aβ25-35and improve cell viability, which might be related with Xingnaojing elevated intracellular ATP contents and the level of mitochondrial membrane potential to protect mitochondria.

Xingnaojing Alzheimer's disease Beta-amyloid proteins ATP Mitochondrial membrane potential

陜西中醫藥大學科研創新基金(項目編號2016PY20)；陜西中醫藥大學第二附屬醫院專項科研計劃項目(項目編號2016ZD02)

712000 陜西省咸陽市陜西中醫藥大學(尚亞細亞)；陜西中醫藥大學第二附屬醫院 [杜菊梅(通信作者)張磊 申艷方 張文青 梁風俊]

R742

A

1007-0478(2017)04-0297-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.04.005