膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒作用的拮抗效應及機制

代 淵 任 波 陳 歡 魏江平 任香怡 付文君 徐世軍

(成都中醫藥大學養生康復學院，四川 成都 611137)

膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒作用的拮抗效應及機制

代 淵 任 波1，2陳 歡1，2魏江平1，2任香怡1，2付文君1，2徐世軍1，2

(成都中醫藥大學養生康復學院，四川 成都 611137)

目的觀察膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒作用的拮抗效應及機制。方法采用大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒模型，觀察膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒率的影響；采用免疫組織化學法觀察膚樂顆粒對顱骨Syk、Fyn和COX-2表達的影響。結果膚樂顆粒高、中、低劑量組大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒率顯著低于模型組(P<0.05)；膚樂顆粒高劑量組顱骨Syk較模型組顯著降低(P<0.05)；膚樂顆粒高、中劑量組顱骨Fyn較模型組顯著降低(P<0.05)；膚樂顆粒高、中、低劑量組顱骨COX-2較模型組顯著降低(P<0.05)。結論膚樂顆粒具有良好的抗過敏作用，其機制與抑制Src家族非受體蛋白酪氨酸激酶激活有關。

膚樂顆粒；抗過敏；Syk；Fyn；COX-2

老年皮膚瘙癢癥至今發病機制不明，一般認為與老年人性腺功能低下，皮脂腺和汗腺分泌功能減退，皮膚干燥和退行性萎縮有關。研究表明過敏因素是老年皮膚瘙癢癥誘發和加重的主要因素之一，而Src家族非受體蛋白酪氨酸激酶磷酸化激活在IgE介導的肥大細胞脫顆粒信號轉導途徑通路具有重要的作用。中醫認為本病屬于“風癢”、“癢風”、“血風瘡”、“谷道癢”等范疇，病機主要責之于血燥生風，膚樂顆粒由制首烏、白鮮皮、赤芍、當歸等7味中藥組成的專利處方，具有滋陰潤燥，養血祛風的功效，臨床適用于老年皮膚瘙癢癥，癥見皮膚干燥瘙癢或肌膚灼熱、情緒煩躁或入夜尤甚或(及)此起彼伏，舌紅苔少或干，脈弦細或弦細數。本研究對膚樂顆粒抑制肥大細胞脫顆粒作用及機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1藥物及試劑 膚樂顆粒(1.67 g原生藥/g)，由成都中醫藥大學中藥炮制與制劑系提供，批號：140715；馬來酸氯苯那敏片(撲爾敏)，太極西南藥業有限公司生產，批號：120308。卵白蛋白，Sigma產品；百白破疫苗，武漢生物制品研究所有限責任公司，批號：20131047-2。甲苯胺藍(進口分裝)，批號：120418，上海如吉生物科技發展有限公司。Syk一抗，兔多克隆抗體，批號：bs-0685R，北京博奧森生物技術有限公司；Fyn一抗，兔多克隆抗體，批號：bs-13236R，北京博奧森生物技術有限公司；COX-2一抗，兔多克隆抗體，批號：bs-0732R，北京博奧森生物技術有限公司。

1.2實驗動物 雄性SD大鼠，體重(200±20)g，SPF級，成都達碩實驗動物有限公司提供，合格證號為：SCXK(川)2013-24。

1.3試驗儀器 轉輪式切片機(徠卡-2016，德國)；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機(常州郊區中威電子儀器廠)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；數碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業集團有限公司)；圖像分析軟件Motic Images Advanced。

1.4抗血清制備 取(100±10)g雄性SD大鼠5只，兩后肢肌肉注射1%卵白蛋白溶液0.5 ml/只，同時腹腔注射百白破疫苗0.5 ml/只，隔日重復致敏一次，共3次。末次致敏13 d后大鼠腹主動脈取血，3 500 r/min，離心10 min，分離血清并合并，-20℃保存備用。

1.5分組及給藥方法 另取SD大鼠60只，體重(200±20)g，按體質量隨機分為空白對照組、模型對照組、馬來酸氯苯那敏片組(撲爾敏，5 mg/kg)、膚樂顆粒高(14 g原生藥/kg)、中(7 g原生藥/kg)、低(3.5 g原生藥/kg)劑量組，每組10只，給藥，10 ml/kg，1次/d，連續6 d。給藥第4天大鼠頭部皮下注射抗血清0.1 ml/只致敏，注射48 h后各組大鼠尾靜脈注射用0.5%伊文思藍溶液配成2 mg/ml的卵白蛋白溶液攻擊，注射量10 ml/kg。30 min后斷頭處死大鼠。

1.6顱骨肥大細胞脫顆粒觀察 常規方法制備顱骨膜骨切片，切片脫蠟復水后在甲苯胺藍溶液染色30 s，蒸餾水洗2次，每次3～5 min，30%酒精分色，在鏡下控制分色時間，以肥大細胞異染顆粒呈紫色為宜。每只大鼠切片選取3個400倍視野，計數肥大細胞總數和脫顆粒數目(包膜出現明顯破裂或有顆粒外逸為脫顆粒)，將相應數值平均即為該點400倍鏡下局部肥大總數和脫顆粒數目。按下式計算肥大細胞脫顆粒率：脫顆粒率(%)=肥大細胞脫顆粒數目/肥大細胞數×100%。

1.7免疫組化法檢測顱骨Syk、Fyn和COX-2表達 采用S-P 法進行免疫組化操作。大鼠顱骨常規制片、脫蠟后滅活內源性過氧化物酶，熱修復抗原后滴加山羊血清封閉，滴加稀釋的一抗(1∶200)4℃過夜，PBS(pH 7.2～7.4)洗3次后滴加二抗封閉，DAB顯色后蘇木素輕度復染，脫水，透明，中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統進行圖像分析，每例標本測3張切片，每張切片的每個測定部位隨機選取三個視野，取平均值。所有平均光密度(IA)值測定均在相同的光學條件下完成。

1.8統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行One-way ANOVA結合Post Hoc檢驗。

2 結 果

2.1膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒的影響 大鼠顱骨切片鏡下背景為淡藍色或無色，肥大細胞胞質呈藍色，胞核為無色，肥大細胞多在硬腦膜血管周圍分布，少數大鼠硬腦膜血管周圍胞質中可見粗大的藍紫色或紫紅色顆粒；模型組切片背景色與空白對照組一致，每只大鼠硬腦膜血管周圍可見大量脫顆粒的肥大細胞，分布面廣、密集，平均光密度值較空白對照組顯著增高(P<0.01)；撲爾敏組染色較模型組淺，分布面積小且分散，平均光密度較模型組顯著降低(P<0.05)，膚樂顆粒高、中、低劑量組染色較模型組淺，每只大鼠硬腦膜血管周圍可見少量脫顆粒的肥大細胞，分布面積小而分散，平均光密度值較模型組顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

2.2膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒模型顱骨Syk表達的影響 Syk主要分布在細胞膜，成淺黃色或棕黃色顆粒見圖2。模型組大鼠顱骨Syk較空白對照組顯著高表達，著色較深，平均光密度值顯著增高(P<0.01)。撲爾敏組Syk較模型組顯著低表達，平均光密度顯著降低(P<0.05)。膚樂顆粒高劑量組Syk較模型組顯著低表達，著色較淺，平均光密度值亦顯著降低(P<0.05)，膚樂顆粒中、低劑量有下降趨勢。見表1。

圖1 各組大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒的比較(甲苯胺藍染色 ，×400)

圖2 各組顱骨Syk表達(DAB,×400)

2.3膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒模型腦膜顱骨Fyn表達的影響 Fyn主要分布在細胞膜，成淺黃色或棕黃色顆粒。模型組大鼠顱骨Fyn較空白對照組顯著高表達，分布面積較廣，著色較深，平均光密度值顯著增高(P<0.01)。撲爾敏組Fyn較模型組顯著低表達，平均光密度顯著降低(P<0.05)。膚樂顆粒高、中劑量組Fyn較模型組顯著低表達，分布面積較窄，著色較淺，平均光密度值亦顯著降低(P<0.05)，膚樂顆粒低劑量組Fyn有下降趨勢，見圖3，表1。

2.4膚樂顆粒對大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒模型腦膜顱骨COX-2表達的影響 COX-2主要分布在細胞質、核膜或間質，成淺黃色或棕黃色顆粒見圖4。模型組大鼠顱骨COX-2較空白對照組顯著高表達，分布面積較廣，著色較深，分布比較集中，平均光密度值顯著增高(P<0.01)，撲爾敏組較模型組COX-2顯著低表達，平均光密度顯著降低(P<0.05)。膚樂顆粒高、中、低劑量組COX-2較模型組顯著低表達，分布面積較窄，著色較淺，平均光密度值亦顯著降低(P<0.05)。見表1。

圖3 各組顱骨Fyn表達(DAB,×400)

圖4 各組顱骨COX-2表達(DAB,×400)

組別脫顆粒率(%)SykFynCOX?2空白對照組6．36±7．792)0．303±0．0192)0．310±0．0132)0．284±0．0052)模型組49．41±3．000．329±0．0100．341±0．0170．331±0．022撲爾敏組29．07±6．132)0．304±0．0142)0．325±0．0151)0．288±0．0082)膚樂顆粒高劑量組23．93±7．652)0．309±0．0181)0．320±0．0132)0．289±0．0072)膚樂顆粒中劑量組28．70±5．422)0．314±0．0110．326±0．0161)0．303±0．0092)膚樂顆粒低劑量組43．16±5．941)0．313±0．0130．339±0．0170．297±0．0052)

與模型組比較：1)P<0.05,P<0.01

3 討 論

老年皮膚瘙癢癥臨床患病率高達40.7%〔1〕，其發病與過敏原尤其是與吸入性過敏原有關〔2〕。肥大細胞作為過敏反應的主要效應細胞，其脫顆粒釋放過敏性介質是導致過敏效應放大的關鍵機制。IgE介導的信號途徑、酪氬酸激酶(Lyn)依賴的激活途徑和Fyn依賴的激活途徑是三條肥大細胞脫顆粒的關鍵途徑〔3〕。肥大細胞表面具有高親和力IgE受體FcεRⅠ，可通過非IgE依賴的非免疫性激活和IgE依賴的免疫激活兩種方式激活。研究表明酪氨酸激酶Lyn是FcεRⅠ交聯后第一個被激活的激酶，Lyn激活之后通過磷酸化γ-I-TAMs激活Syk〔4〕。因此認為Lyn、Syk是細胞活化脫顆粒IgE/FcεRⅠ介導的信號通路的源頭按鈕，Lyn和Syk的激活可進一步激活下游多條信號通路，引起胞內鈣離子濃度的升高，誘導炎癥介質的合成與釋放，最終導致細胞活化脫顆粒。此外，受體的聚集交聯之后亦可激活Fyn，進而激活Fyn依賴的Gab2，激活的Gab2隨后引起磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶C(PKC)的活化〔5〕，通過激活下游通路引起過敏介質的合成和釋放。研究表明即使在FcεRI，Syk，LAT和ERK2仍然發生磷酸化的情況下，Fyn 的缺失會破壞PIP3 的活化和肥大細胞的脫顆粒〔5〕。由此可見，Src 家族非受體蛋白酪氨酸激酶(PTKs)Syk和Fyn在肥大細胞脫顆粒信號途徑中扮演著細胞信號中轉和下游“放大器”的角色。此外，在Lyn-Syk 激酶依賴的肥大細胞脫顆粒信號途徑過程中，花生四烯酸的代謝產物也被激活，調節MAPK和PLA2〔6〕。一旦PLA2 激活便轉位至細胞膜，肥大細胞繼而釋放花生四烯酸并且募集白三烯和前列腺素。COX-2是花生四烯酸代謝過程中的關鍵酶，在前列腺素類介質的生成中具有重要作用。本研究結果說明膚樂顆粒具有拮抗模型大鼠顱骨肥大細胞脫顆粒的作用，其機制與抑制Src家族非受體蛋白酪氨酸激酶激活和抑制前列腺素類過敏介質的生成和釋放有關。

1彭學標.老年人的瘙癢性皮膚病〔J〕.中國皮膚性病學雜志，2000；14(3)：173-4.

2吳躍申，水潤英，徐琴言，等.老年皮膚瘙癢癥患者血清特異性IgE的檢測分析〔J〕.中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2004；3(2)：89-90.

3李 敏，周 建，蔣春雷.IgE 介導的肥大細胞脫顆粒信號轉導途徑的研究進展〔J〕.現代生物醫學進展，2009；9(18)：3539-42.

4Beavitt SJE，Harder KW，Kemp JM，etal.Lyn-deficient mice develop severe，persistent asthma：Lyn is a critical negative regulator of Th2 immunity〔J〕.J Immunol，2005；175(3)：1867-75.

5Parravicini V，Gadina M，Kovarova M，etal.Fyn kinase initiates complementary signals required for IgE-dependent mast cell degranulation〔J〕.Nature Immunol,2002；3(8)：741-8.

6Hamawy MM，Mergenhagen S，Eand Siraganian R，etal.IgE-dependent mast cell activatidion：protein tyrosine phosphorylation as a mechanism of signaling in mast cells and basophils〔J〕.Cell Signal，1995；7：535-44.

〔2016-04-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

四川省科技支撐項目(No.2014SZ0071-09)；四川省苗子工程項目(No.2014-095)

徐世軍(1975-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事中藥藥理學研究。

代 淵(1975-)，女，博士，副教授，主要從事中醫老年性疾病研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)16-3911-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.002

1 四川省中藥資源系統研究與開發利用國家重點實驗室培育基地

2 成都中醫藥大學藥學院