苦參堿通過PKA/CREB信號通路對阿爾茨海默病大鼠認知障礙及神經炎癥的調節作用

呂 路 梅 蕊 王 昉 彭 樊

(武漢市精神衛生中心精神科，湖北 武漢 430022)

苦參堿通過PKA/CREB信號通路對阿爾茨海默病大鼠認知障礙及神經炎癥的調節作用

呂 路 梅 蕊 王 昉 彭 樊1

(武漢市精神衛生中心精神科，湖北 武漢 430022)

目的探討苦參堿通過蛋白激酶A(PKA)/CAMP反應元件結合蛋白(CREB)信號通路對阿爾茨海默病(AD)認知障礙及神經炎癥的調節作用。方法48只SD雄性大鼠，隨機分為假手術組、模型組、苦參堿組。處理7 d后，Morris水迷宮實驗檢測大鼠認知功能；放射免疫檢測大鼠血清及海馬組織中炎癥因子白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6含量；Western印跡檢測膠質細胞標記蛋白如離子鈣結合蛋白(Iba)-1、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)及PKA/CREB信號通路蛋白表達情況。結果與假手術組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，空間探索能力明顯下降，Iba-1、GFAP的表達顯著增高，炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6含量明顯增多，p-PKA及p-CREB表達顯著降低(均P<0.01)。與模型組相比，苦參堿組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，空間探索能力顯著增強，Iba-1、GFAP的表達明顯降低，炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量明顯下降，p-PKA及p-CREB表達明顯增強(均P<0.01)。與假手術組相比，苦參堿組各檢測指標均無顯著性差異(P>0.05)。結論苦參堿能顯著改善AD大鼠認知障礙，抑制神經炎癥，作用機制可能與PKA/CREB信號通路的活化有關。

苦參堿；阿爾茨海默??；認知障礙；神經炎癥；小膠質細胞

阿爾茨海默病(AD)是一種常發于老年人的中樞神經退行性疾病，主要表現為記憶力減退、自理能力下降，同時伴有各種精神類疾病及行為障礙，其發病率隨著年齡的增長急劇升高，65歲以上人群發病率約為30%，85歲以上患病率增至65%〔1〕。目前對AD尚無有效的治療方法。苦參堿是自苦參中提取得到的一種生物堿，具有清熱燥濕、利尿等作用〔2〕?？鄥A具有廣泛的藥理作用，臨床上已被用于乙型肝炎的治療〔3〕。研究發現苦參堿還能防止大鼠肝纖維化，除此之外還具有抗感染、鎮痛、抗腫瘤等作用〔4～6〕。但是關于將苦參堿應用于AD治療的報道很少，相關的作用機制也不清楚。本研究采用β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42雙側注射大鼠海馬區構建AD大鼠模型，利用苦參堿進行治療，探討苦參堿對AD大鼠認知障礙、神經膠質細胞活化及炎癥因子釋放的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院提供；苦參堿注射液購自廣州白云山明興制藥有限公司；Aβ1～42、蛋白酶抑制劑購自美國Sigma；離子鈣結合蛋白(Iba)-1單克隆抗體、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體、蛋白激酶A(PKA)單克隆抗體、磷酸化(p)-PKA單克隆抗體、CAMP反應元件結合蛋白(CREB)單克隆抗體、p-CREB單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗均購于美國Abcaminc；放射免疫試劑盒購自北京福瑞生物公司；Morris水迷宮購自中國醫學科學院藥物研究所；腦立體定位儀購自日本Nikon。

1.2方法

1.2.1分組及AD模型制備 使用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配制濃度為1 μg/μl的Aβ1～42溶液，37℃恒溫孵育7 d，直至溶液凝聚。取48只健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，隨機分為假手術組、模型組、苦參堿組。大鼠麻醉處理后進行固定，參照《大鼠腦立體定位圖譜》對大鼠海馬區進行定位。消毒后使用電鉆在定位處鉆一小孔，垂直緩慢注射10 μl的Aβ1～42溶液，模型組及苦參堿組雙側海馬區各注射10 μl，假手術組注射10 μl無菌0.01 mol/L PBS溶液。完成注射后，使用無菌的石蠟封堵針口，并對頭皮進行縫合。

1.2.2各組大鼠處理方法 造模后苦參堿組大鼠每日腹腔注射苦參堿注射液40 mg/kg 1次，假手術組和模型組每日腹腔注射等體積的生理鹽水，連續處理30 d。

1.2.3Morris水迷宮檢測大鼠認知能力 各組大鼠處理7 d后，每組選6只大鼠，隨機選擇象限面向池壁放入水中，記錄各只大鼠尋找到平臺所需時間，若大鼠90 s內尋找到平臺，讓大鼠在平臺停留10 s，若大鼠無法在90 s內尋找到平臺，取出大鼠置于平臺10 s，并計時90 s。訓練5 d后，采用不同入水點將大鼠放入水中，記錄大鼠尋找到平臺的時間。撤除水迷宮中的平臺，隨機選取入水點將大鼠放入水中，記錄90 s內大鼠穿過原平臺所在區域的次數，并進行統計。

1.2.4血清及海馬組織炎癥因子含量檢測 每組隨機選擇6只大鼠麻醉后取心臟采集血液，離心后上清轉移至新的離心管中備用。同時，自腦分離出海馬組織，勻漿后離心取上清。按照放射免疫試劑盒說明進行操作，分別檢測血清及海馬組織勻漿液中白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6的含量。

1.2.5提取大鼠海馬組織總蛋白 每組隨機選擇6只大鼠進行處死后取海馬組織，每組各取50 mg剪碎后置于離心管中，向離心管中加入500 μl蛋白裂解液及5 μl蛋白酶抑制劑進行勻漿。取0.5 ml勻漿液轉移到新的離心管中，加入1 ml蛋白抽提液和10 μl蛋白酶抑制劑，混勻后冰上靜置10 min，離心取中間層溶液，加入2%的十二烷基硫酸鈉(SDS)，95℃處理10 min，即為所提取蛋白，采取二喹啉甲酸(BCA)法檢測所提取的蛋白濃度。

1.2.6Western印跡檢測蛋白表達 分別取50 μg蛋白樣品，按4∶1加入5倍(SDS )上樣緩沖液，混勻后100℃煮沸5 min制備蛋白樣品。配置蛋白膠，蛋白膠凝固后將蛋白樣品完全加入蛋白凝膠孔中。80 V電泳30 min，待蛋白進入分離膠后電壓調至120 V繼續電泳，直至溴酚藍跑出蛋白凝膠。取出蛋白膠冰浴條件下轉膜，轉膜完成后，取出聚偏氟丙烯(PVDF)膜，使用5%脫脂奶粉封閉3 h，分別加入Iba-1(1∶1 000)、GFAP(1∶800)、PKA(1∶500)、p-PKA(1∶1 000)、CREB(1∶500)、p-CREB(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)一抗4℃輕輕震蕩孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)，常溫輕輕震蕩孵育1 h，TBST清洗后，加入化學發光試劑，置于Quantity One圖像分析系統中成像。

1.3統計學方法 應用SPSS21.0統計學分析軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1苦參堿對AD大鼠認知功能的影響 與假手術組相比，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，第2天開始顯著高于假手術組(P<0.01)；與模型組相比，苦參堿組明顯縮短，自第3天開始顯著低于模型組(P<0.01)?？臻g探索實驗結果顯示，模型組大鼠90 s內穿過平臺的次數〔(1.91±0.95)次〕顯著低于假手術組〔(5.29±1.12)次〕(P<0.01)，與模型組相比，苦參堿組次數〔(3.17±1.29)次〕明顯增多(P<0.01)。苦參堿組與假手術組各檢測結果無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2苦參堿對AD大鼠膠質細胞活化的影響 與假手術組相比，模型組Iba-1、GFAP蛋白表達顯著增強(P<0.01)；與模型組相比，苦參堿組均明顯降低(P<0.01)；苦參堿組與假手術組相比兩種蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。見表2，圖1。

2.3苦參堿對AD大鼠血清及海馬組織炎癥相關因子表達的影響 與假手術組相比，模型組大鼠血清及海馬組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，苦參堿組均顯著降低(P<0.01)，苦參堿組與假手術組炎癥因子的表達無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較(±s，s，n=6)

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；下表同

圖1 Western印跡檢測大鼠海馬Iba-1、GFAP蛋白表達

組別Iba?1GFAP假手術組0215±00260298±0036模型組0510±00911)0562±00731)苦參堿組0363±00192)0338±00262)

表3 各組大鼠血清及海馬組織中炎癥因子含量比較(±s，μg/L，n=6)

2.4苦參堿對AD大鼠海馬組織PKA/CREB通路蛋白表達的影響 三組大鼠海馬組織中PKA、CREB蛋白表達未出現顯著性變化(P>0.05)，模型組p-PKA和p-CREB的表達顯著低于假手術組(P<0.01)；與模型組相比，苦參堿組p-PKA和p-CREB表達明顯升高(P<0.01)；苦參堿組與假手術組相比，PKA及CREB蛋白磷酸化無明顯差異(P>0.05)。見表4，圖2。

表4 大鼠海馬組織PKA/CREB通路蛋白相對表達分析(±s，n=6)

圖2 Western印跡檢測大鼠海馬組織PKA/CREB通路蛋白表達

3 討 論

AD臨床上是以記憶減退、認知障礙及人格改變為主要特征的中樞神經退行性疾病，研究發現AD發病與Aβ在腦內的沉積密切相關，Aβ沉積激活炎癥修復機制導致腦部慢性炎癥損傷，可能是AD的發病原因〔7〕。Aβ主要包括Aβ1～40和Aβ1～42蛋白，Aβ蛋白在AD患者腦內主要以Aβ1～42形式存在，Aβ1～42在細胞外沉積后，能持續激活腦內炎癥反應，誘導大量的炎癥因子產生〔8〕。實驗證明，海馬區注射Aβ1～42能更有效建立AD模型〔9〕。本研究通過向大鼠腦部海馬區注射Aβ1～42成功制備了AD大鼠模型。

苦參堿是苦參、苦豆子、山豆根等豆科植物的活性成分，具有清熱解毒、抗感染、免疫調節等功效。有研究證明苦參堿對麻醉小鼠腦膜血管具有擴張作用，加快局部血流量；其還能明顯抑制腦缺血大鼠環氧化酶(COX)-2的過度表達及膠質細胞的活化，抑制腦部炎癥反應〔10〕。本實驗結果說明苦參堿能顯著改善AD大鼠的學習和記憶功能。

AD發病過程中的神經炎癥過程與腦內小膠質細胞和星形膠質細胞的活化有關〔11，12〕。小膠質細胞是一種免疫細胞，致炎因素刺激后活化并分泌IL-6、TNF-α等炎癥因子，星形膠質細胞受到外界刺激后活化，進而誘導產生大量的炎癥介質，如IL-1β、IL-6、TNF-α等〔13〕。這些細胞因子反過來進一步激活小膠質細胞及星形膠質細胞，進一步刺激炎癥因子的分泌，最終導致神經元病變壞死〔14〕，病人出現癡呆等癥狀。Iba-1是小膠質細胞特異標記蛋白，GFAP是星形膠質細胞特異標記蛋白〔15〕，本研究結果利用放射免疫檢測各組大鼠血清及海馬組織中炎癥因子的含量，結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠血清及海馬組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均明顯升高，與模型組相比，苦參堿組三種炎癥因子的含量顯著降低，苦參堿組與假手術組炎癥因子的表達無明顯差異。說明苦參堿能抑制AD大鼠膠質細胞的活化，抑制炎癥的發生。

cAMP是機體內重要的第二信使，通過PKA調節CREB的磷酸化，p-CREB抑制炎癥因子表達相關的CRE轉錄因子的活性，抑制炎癥的發生〔16〕；活化PKA/CREB信號通路還能調節下游與神經保護相關蛋白的表達，從而起到保護神經的作用〔17〕。本研究結果說明苦參堿能活化AD大鼠PKA/CREB信號通路。

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〔2017-03-16修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

王 昉(1980-)，女，主治醫師，主要從事精神科研究。

呂 路(1978-)，男，主治醫師，主要從事精神科研究。

R965

A

1005-9202(2017)16-3931-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.010

1 武漢市中醫醫院精神科