程序性死亡因子4在宮頸鱗癌中的表達及其生物學意義

高 寒 王瑛堅

(長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031)

程序性死亡因子4在宮頸鱗癌中的表達及其生物學意義

高 寒 王瑛堅1

(長春醫學高等專科學校，吉林 長春 130031)

目的探討程序性死亡因子(PDCD)4蛋白在子宮頸鱗癌組織中的表達及其生物學意義。方法采用免疫組織化學(SP)法及逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測16例正常子宮頸組織和70例子宮頸鱗癌組織中PDCD4的表達情況，并分析其與宮頸鱗癌生物學行為的關系。結果PDCD4在正常子宮頸組織、子宮頸鱗癌組織中的表達率差異有統計學意義(P<0.01)；子宮頸鱗癌組織中PDCD4表達下降，與子宮頸鱗癌的分化程度及分期相關(P<0.01)。結論PDCD4在子宮頸鱗癌組織中異常表達與子宮頸鱗癌發生及惡性程度密切相關，檢測其在癌組織中的表達水平對子宮頸鱗癌病理診斷、預后具有重要意義。

宮頸鱗癌；程序性死亡因子4；逆轉錄聚合酶鏈反應

近年來，子宮頸鱗癌的發病率與死亡率都呈明顯上升趨勢，其機制尚不清楚〔1〕。有研究認為，子宮頸鱗癌的發生、發展和轉歸與宮頸組織細胞增殖及凋亡的失衡密切相關〔2〕。程序性細胞死亡因子(PDCD)4作為凋亡調控分子，通過抑制核糖體復合物形成及蛋白質合成，從而影響細胞周期及凋亡〔3〕。最近研究表明，PDCD4作為新發現的抑癌基因，在乳腺癌、肺癌、腸癌、鼻咽癌等多種人腫瘤組織中表達缺失或低表達〔4〕。目前，PDCD4與子宮頸癌之間的關系國內尚未見報道，本研究旨在探討子宮頸鱗癌中PDCD4的表達及其與分化程度和病理分期的關系。

1 材料與方法

1.1材料及試劑 收集吉林省2003～2015年經病理學檢查確診的子宮肌瘤和子宮頸癌手術切除標本86例，其中子宮頸癌70 例(組織學類型均為鱗癌)，16 例因子宮肌瘤切除的正常子宮頸上皮組織作為對照。70例子宮頸鱗癌按病理學分化程度分為高分化24例，中分化21例，低分化25例。患者年齡32～76 歲，中位年齡54歲。每例標本術前均未接受化療和放療等抗腫瘤治療。

1.2檢測方法 采用免疫組織化學(SP)法及逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法，檢測16例正常子宮頸和70例子宮頸鱗癌組織中PDCD4的表達。所用兔PDCD4多克隆抗體工作濃度均為1∶200。具體實驗步驟參照SP法檢測試劑盒說明書及RT-PCR試劑盒說明書進行操作。

1.3結果判定

1.3.1SP法檢測結果判定 當觀察到細胞內出現黃褐色或棕黃色顆粒時表示PDCD4蛋白陽性表達，主要以細胞質及核周為主。觀察染色，在高倍顯微鏡下(400倍)觀察并隨機選取每張切片中3～5個視野進行計數，根據細胞染色強度和陽性率進行評分判定。將PDCD4表達強度分為：陰性(-)、弱陽性(+)、陽性()、強陽性()。(1)染色強度計分：未著色計0分，染色弱染為淺黃色計1分，染色較強染為棕黃色計2分；染色強染為黃褐色計3分。(2)陽性率計分：未觀察到陽性細胞或陽性細胞率<10%為陰性(-)計0分，陽性細胞率11%～30%計1分，31%～60%計2分，>60%計3分。計算兩種分值和，相加分值≥3分為陽性〔5〕。

1.3.2RT-PCR檢測結果判定 將PCR圖像輸入上海天能凝膠分析系統進行表達強度的分析，對照Marker，PDCD4 mRNA陽性表達表現在PDCD4相應位置248 bp處出現特異性條帶，陰性表達則是在對應區域未出現陽性條帶。GAPDH長度為616 bp。以 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定特異性片段。PDCD4 mRNA表達的相對含量測定是利用內參照GAPDH光密度值標化PDCD4 mRNA的吸光度值得到，即PDCD4相對含量=(PDCD4光密度值/GAPDH光密度值)×100。

1.4統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行χ2、t檢驗。

2 結 果

2.1SP法檢測結果 所有樣本染色特異性均良好，觀察發現在正常宮頸組織中PDCD4陽性顆粒主要定位于細胞質及核周，以鱗狀上皮的基底細胞、棘細胞為主，呈棕黃色或黃褐色顆粒；而PDCD4陽性顆粒在宮頸鱗癌組織細胞質中也可見，并且會隨著宮頸鱗癌分化程度的降低逐漸減少，具體表現為高分化宮頸鱗癌組織中PDCD4表達可為甚至，以細胞質為主；中分化表達主要為+；而低分化表達為+或者-。PDCD4在宮頸鱗癌中-50例，+11例，5例，4例；在正常宮頸組織PDCD4陽性率(87.50%，+2例，4例，8例)和高分化宮頸鱗癌組織中陽性率〔16例(66.67%)〕差異無統計學意義(P>0.05)，在中分化、低分化的宮頸鱗癌組織中陽性表達〔3例(14.28%)，1例(4.00%)〕越來越低，與正常宮頸組織相比較差異顯著(P<0.01)。

圖1 PDCD4在正常子宮頸上皮細胞、高、中、低分化宮頸鱗癌中的表達(SP，×400)

2.2RT-PCR檢測結果 16例正常宮頸組織中有14例(87.5%)、70例宮頸鱗癌組織中有20例(28.57%)擴增出特異性片段。PDCD4 mRNA在正常宮頸組織、高分化、中分化及低分化宮頸鱗癌組織中的表達強度分別為(1.734±0.279)、(2.161±0.468)、(1.154±0.184)和(0.626±0.231)。PDCD4 mRNA在高分化宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織中的表達差異無統計學意義(P>0.05)，而在中、低分化宮頸鱗癌組織中的表達與正常宮頸組織比較均有顯著差異(P<0.01)。見圖2。

M：DL 2 000 marker 1:正常宮頸；2:高分化宮頸鱗癌；3：中分化宮頸鱗癌；4：低分化宮頸鱗癌圖2 PDCD4 mRNA在正常宮頸、宮頸鱗癌組織中的表達

3 討 論

子宮頸癌是常見的婦科腫瘤之一，其發生發展與基因異常表達有關，是一個涉及多基因、復雜的演變過程〔6〕，如基因結構和表達異常、細胞超微結構的改變等都可以導致細胞過度增殖，從而引起惡性腫瘤發生發展。目前研究認為癌基因、抑癌基因及凋亡基因的異常改變，是宮頸鱗癌發生發展的關鍵環節〔7〕。

PDCD4是新近發現的一種抑癌基因，位于人類染色體10q24，PDCD4作為凋亡調控分子，通過抑制核糖體復合物形成及蛋白質合成，從而影響細胞周期及凋亡。最近研究表明，PDCD4作為新發現的抑癌基因，在乳腺癌、肺癌、腸癌、鼻咽癌等多種人腫瘤組織中表達缺失或低表達〔4,8〕，而PDCD4的缺失或低表達嚴重影響腫瘤細胞的凋亡，造成腫瘤細胞無限增殖，從而促進乳腺癌、肺癌、腸癌、鼻咽癌等癌癥的發展，加快患者病情的惡化。另外，研究發現PDCD4也可抑制C-JUN末端的磷酸化繼而抑制腫瘤的轉移〔9〕，C-JUN信號通路與細胞增殖、遷移侵襲轉移都有關聯，PDCD4通過抑制C-JUN分子磷酸化，從而阻滯C-JUN信號通路傳導，進而抑制細胞增殖與遷移侵襲。

本研究結果提示PDCD4低表達或表達缺失與宮頸鱗癌的發生密切相關。同時，PDCD4在宮頸鱗癌組織中的表達水平與宮頸鱗癌的分化程度有關，分化程度越低，PDCD4表達水平越低甚至缺失，PDCD4可以影響宮頸鱗癌的發展過程。

1胡尚英,鄭榮壽,趙方輝，等.1989至2008年中國女性子宮頸癌發病和死亡趨勢分析〔J〕.中國醫學科學院學報,2014;36(2):119-25.

2Prakash P,Patne SC,Singh AK,etal.PCR and genotyping for HPV in cervical cancer patients〔J〕.J Glob Infect Dis,2016;8(3):100-7.

3高 寒.PDCD4、MMP-14在宮頸鱗癌中的表達及其生物學意義〔D〕.長春：吉林大學,2010.

4Schmid T,Blees JS,Bajer MM,etal.Diaryl disulfides as novel stabilizers of tumor suppressor pdcd4〔J〕.PLoS One,2016;11(3):e0151643.

5Wang Y,Guan S,Zhao G,etal.Expressions of aquaporin-4,matrix metallo-proteinase-2 and matrix metallo-proteinase-14 in peritumor edematous zone of glioma and clinical implications〔J〕.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2014;94(29):2290-2.

6De Marchi T,Liu NQ,Stingl C,etal.4-protein signature predicting tamoxifen treatment outcome in recurrent breast cancer〔J〕.Mol Oncol,2016;10(1):24-39.

7Mallmann P,Mallmann C.Neoadjuvant and adjuvant chemotherapy of cervical cancer〔J〕.Oncol Res Treat,2016;39(9):522-4.

8Biyanee A,Singh P,Klempnauer KH.Translation,PDCD4 and eIF4A〔J〕.Oncoscience,2015;2(9):731-2.

9Cho JH,Kim YW,Choi BY,etal.Sulforaphane inhibition of TPA-mediated PDCD4 downregulation contributes to suppression of c-Jun and induction of p21-dependent Nrf2 expression〔J〕.Eur J Pharmacol,2014;741:247-53.

〔2017-01-05修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

吉林省科技發展計劃項目(No.20140414018GH)

王瑛堅(1970-)，女，副教授，主要從事婦科腫瘤臨床研究。

高 寒(1975-)，女，碩士，副教授，主要從事病理學與病理生理學研究。

R73

A

1005-9202(2017)16-3934-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.011

1 吉林大學中日聯誼醫院