氯吡格雷對大鼠心肌缺血/再灌注心肌細胞凋亡及氧自由基的作用及機制

徐 玲 蔡銀鏈 許朝祥

(福建醫科大學附屬第二醫院心內科，福建 泉州 362000)

氯吡格雷對大鼠心肌缺血/再灌注心肌細胞凋亡及氧自由基的作用及機制

徐 玲 蔡銀鏈 許朝祥

(福建醫科大學附屬第二醫院心內科，福建 泉州 362000)

目的觀察體外給予氯吡格雷干預對大鼠心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)心肌細胞凋亡與氧自由基的作用，分析其機制。方法Wistar大鼠120只隨機分為假手術組(Sham組)、MIRI組及治療組(給予氯吡格雷干預)各40只，觀察各組心肌酶學指標，心臟梗死面積，組織病理學改變，Caspase-3及程序性細胞凋亡因子(PDCD)-5表達及超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量變化情況。結果在組織病理學方面，光鏡下可見，Sham組細胞結構完整，橫紋清楚，排列整齊。MIRI組細胞排列紊亂，壞死嚴重。治療組細胞存在細胞水腫現象，但橫紋較MIRI組清楚。與Sham組相比，MIRI組及治療組乳酸脫氫酶(LDH)及磷酸肌酸肌酶(CPK)含量顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，治療組LDH及CPK含量顯著降低(P<0.05)。與Sham組相比，MIRI組及治療組心臟梗死面積顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，治療組心臟梗死面積顯著降低(P<0.05)。光鏡下，Sham組基本未見Caspase-3及PDCD-5陽性細胞；MIRI組隨處可見大量Caspase-3及PDCD-5陽性細胞；相比于Sham組，治療組Caspase-3及PDCD-5陽性細胞含量明顯增加，但相對于MIRI組，治療組陽性細胞含量明顯降低(P<0.05)。與Sham組相比，MIRI組及治療組SOD含量顯著降低，MDA含量顯著升高(P均<0.05)；與MIRI組相比，治療組SOD含量顯著降低，MDA含量顯著升高(P均<0.05)。結論氯吡格雷可縮小心肌梗死面積，減輕水腫情況，抑制Caspase-3及PDCD-5凋亡因子的生成，降低心臟內氧自由基分泌從而達到保護大鼠心臟功能，改善MIRI。

氯吡格雷；缺血/再灌注損傷；Caspase-3；程序性細胞凋亡因子(PDCD)-5；細胞凋亡；超氧化物歧化酶(SOD)；丙二醛(MDA)

冠心病發病過程中，心肌缺血再灌注損傷(MIRI)導致的細胞凋亡是冠心病損傷的重要機制之一，而最大程度的抑制凋亡已經成了治療的關鍵〔1〕。研究證實，Caspase蛋白酶是與凋亡關系最為密切的因子之一，可水解底物蛋白，降解細胞內產物，導致染色體斷裂，最終使細胞走向死亡，其中Caspase-3是該家族中最為關鍵的因子〔2〕。程序性細胞凋亡因子(PDCD)-5是與凋亡相關因子，研究發現其在多種疾病中起著重要作用〔3〕。氯吡格雷是近幾年應用于臨床中治療冠心病的藥物，其可通過拮抗二磷酸腺苷發揮抗血小板作用，從而發揮藥物作用〔4〕。本研究構建老年MIRI大鼠，給予氯吡格雷干預，觀察該療法改善心肌細胞凋亡的作用。

1 資料與方法

1.1動物模型構建及分組 參考相關文獻〔5〕，建立MIRI大鼠模型。7.2%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，行氣管切開并給予人工通氣，并連接小動物心電圖機。胸骨左緣3～5肋間開胸，暴露心臟，于左心耳與肺動脈圓錐交界處下3～4處結扎左前降支，并在冠脈與結扎線之間固定一細管，使細管壓迫冠狀動脈，心電圖出現ST段抬高，說明急性心肌缺血模型誘導成功。壓迫45 min后，移除細管，使血液再灌注心臟，心臟顏色變磚紅，ST段出現下降一半以上，說明再灌注模型成功。從北京華阜康生物公司購置Wistar大鼠120只，隨機分為3組，每組40只，均在構建模型前給予對應干預，分為假手術組(Sham組)，MIRI組和治療組(給予氯吡格雷干預)。Sham組操作同MIRI組，但只穿線不結扎。治療組給予氯吡格雷(法國 Sanofi Pharma Bristol-Myers Squibb SNC公司)灌胃，3 mg/kg，喂服5 d。Sham、MIRI組行等量的生理鹽水灌胃，再灌注3 h后取大鼠組織及血液進行后續實驗。

1.2心臟組織病理形態檢測 磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注后，取大鼠心臟組織，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，包埋，切片后進行HE染色，光鏡下觀察心臟組織形態。

1.3心臟梗死面積測定 PBS灌注后，取大鼠心臟組織，做冠狀切片，應用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色測定心臟梗死面積，按照梗死區占整個切片的百分比測定梗死面積。左心耳連接灌流裝置，實時監測左心室功能，包括心率，左室發展壓及冠脈流量。

1.4免疫組化檢測Caspase-3及PDCD-5的表達 將石蠟切片脫蠟，二甲苯透明，梯度酒精脫水，PBS清洗，抗原修復，添加Caspase-3及PDCD-5一抗(購于CST公司)過夜孵育，第2天二抗孵育，室溫靜置2 h，PBS清洗，二氨基聯苯胺(DAB)及蘇木精染色，清洗后封片顯微鏡觀察。

1.5血清心肌酶學檢測 血清常溫靜止2 h后，高速12 000 r/min離心15 min，取上清至于新的離心管深凍冰箱保存備用。應用乳酸脫氫酶(LDH)及磷酸肌酸肌酶(CPK)試劑盒(均購于碧云天試劑公司)檢測血清心肌酶，嚴格按照說明書及文獻配置多種試劑及顯色劑及操作。

1.6超氧化物歧化酶(SOD)檢測 應用SOD試劑盒(碧云天試劑公司)，嚴格按照說明書及文獻配置多種試劑及顯色劑及操作〔3〕，并應用儀器檢測血清吸光度。SOD(U/ml)=(對照管吸光度-測定管吸光度)/對照管吸光度×50%×稀釋倍數。

1.7丙二醛(MDA)檢測 應用MDA試劑盒(碧云天試劑公司)，采用熒光檢測法，嚴格參照說明書及相關文獻配置試劑及標準品〔3〕，試劑混勻后95℃水浴40 min，再流水沖洗，3 500 r/min離心10 min，取血清后測定吸光度。MDA(nmol/ml)=(測定管吸光度-測定空白管吸光度)/(標準吸光度-標準空白管吸光度)×標準品濃度×稀釋倍數。

1.8統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組心臟組織病理形態 見圖1。光鏡下可見，Sham組細胞結構完整，橫紋清楚，排列整齊。MIRI組細胞排列紊亂，壞死嚴重。治療組存在細胞水腫現象，但橫紋較MIRI組清楚。

圖1 各組心臟組織病理形態(×400)

2.2各組血清心肌酶學指標比較 與Sham組相比，MIRI組及治療組LDH及CPK含量顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，治療組LDH及CPK含量顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.3各組心肌梗死率比較 與Sham組〔(0.5±0.019)%〕相比，MIRI組及治療組心肌梗死率〔(31.6±9.9)%、(14.5±8.9)%〕顯著升高(P<0.05)；與MIRI組相比，治療組心肌梗死率顯著降低(P<0.05)。

2.4各組心肌組織Caspase-3及PDCD-5表達 光鏡下，Sham組基本未見Caspase-3、PDCD陽性細胞；MIRI組隨處可見大量Caspase-3、PDCD陽性細胞；與Sham組比較，治療組Caspase-3、PPCD陽性細胞含量明顯增加，與MIRI組比較，治療組Caspase-3、PPCD陽性細胞含量明顯降低(P<0.05)，見圖2、圖3。

表1 各組血清心肌酶學指標比較(U/L，±s，n=40)

與Sham組比較：1)P<0.05；與MIRI組比較：2)P<0.05；下表同

圖2 各組心肌組織Caspase-3表達(×400)

圖3 各組心肌組織PDCD-5表達(×400)

2.5各組SOD及MDA含量比較 與Sham組相比，MIRI組及治療組SOD含量顯著增高，MDA含量顯著降低(P<0.05)；與MIRI組相比，治療組SOD含量顯著增高，MDA含量顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組SOD及MDA含量比較(±s，n=40)

3 討 論

MIRI是多種心臟疾病，如冠心病、心肌梗死的常見發病原因，致病機制復雜，至今沒有明確的機制解釋清楚，但盡早地恢復血流是治療疾病的根本，較長時間的缺血缺氧可導致心肌細胞及組織凋亡壞死。研究表明，3條信號通路可以干預凋亡：①線粒體凋亡通路，線粒體是細胞內主要產能細胞器，為細胞的各種功能和穩態的維持提供能量。該凋亡通路中重要的因子為細胞色素C及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路相關蛋白，接收到凋亡信號刺激后，細胞質內凋亡蛋白釋放，激活下游Caspase-3、PDCD-5等凋亡蛋白，從而誘發了細胞的程序性死亡〔6〕。②內質網凋亡途徑，病理因素可導致內質網中Caspase-12的高表達，從而誘發Caspase-3、PDCD-5等凋亡分子的激活〔7〕。③死亡受體通路，多種體外刺激物激活死亡受體，從而誘導細胞內Caspase-3等效應酶，從而引起細胞凋亡〔8〕。在多種凋亡通道中，Caspase-3處于凋亡系統的中心環節，多種因子及通道均可激活Caspase-3分子，從而啟動細胞凋亡。線粒體凋亡通路，內質網凋亡途徑，死亡受體通路，這三種通路最終都通過激活下游Caspase-3、PDCD-5等凋亡蛋白，從而誘發了細胞的程序性死亡〔8〕。Caspase-3處于凋亡系統的中心環節，多種因子及通道均可激活Caspase-3分子，從而啟動細胞凋亡。PDCD-5是新近發現的凋亡因子，其在凋亡過程中起著早期及始動性的功能，PDCD-5可誘發線粒體凋亡通路。與此同時，機體在正常情況下可以清體清除體內多余的自由基，然而在缺血缺氧的情況下，機體內會出現較多的氧自由基的積聚，從而加重心肌組織的損害。SOD是主要的抗氧化酶，能有效地清除體內自由基〔9〕；而MDA與線粒體膜的穩定性呈負相關〔10〕，因此通過測定兩者情況可以評估心臟內氧自由基水平。

氯吡格雷作為一種血小板受體阻斷劑，因較小的副作用廣泛應用于臨床，然而有關其調控細胞凋亡的機制仍然不清楚。本研究提示在組織形態方面，氯吡格雷可以顯著改善心肌缺血進展。在血清心肌酶學方面，氯吡格雷可以顯著改善心臟功能。在SOD及MDA方面比較，提示減弱疾病發展的機制中伴隨氧自由基的改善。在凋亡相關因子Caspase-3及PDCD-5表達方面，提示氯吡格雷可以通過降低心肌組織的凋亡情況來改善疾病的發生發展。這一結果首先驗證了PDCD-5這一新型因子在凋亡過程中的重要作用，也提示了氯吡格雷的抗凋亡能力，這一結論與國內在冠脈微栓塞模型研究結果吻合〔11〕。氯吡格雷可通過調控血小板功能、炎性細胞因子分泌及患者心功能來改善心臟疾病的發生發展〔12～14〕。本文結果提示，氯吡格雷可以較大程度改善MIRI大鼠心臟功能，并且其機制與減弱心肌凋亡及氧自由基密切相關。

1董淑雯.參力保與二氮嗪對家兔心肌缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(18)：4428-9.

2趙 彬，劉 斌，張玉芹，等.依達拉奉對腦出血大鼠血腫周圍組織Caspase-3和Pdcd-5蛋白表達的影響〔J〕.天津醫藥，2012；40(5)：483-5.

3劉 斌，周 云，李建民，等.腦出血大鼠血腫周圍組織細胞凋亡與胱冬酶-3和程序性細胞死亡分子-5蛋白表達〔J〕.國際腦血管病雜志，2010；18(10)：735-9.

4李曉峰，徐 峰，李 林，等.急診經皮冠脈介入治療后急性心肌梗死患者氯吡格雷抵抗的發生率及影響因素〔J〕.中國醫科大學學報，2015；44(7)：632-5.

5董淑雯.參力保與二氮嗪對家兔心肌缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(18)：4428-9.

6薛冬梅，洪天配，李 琳，等.胰升糖素樣肽1逆轉細胞因子誘導胰島β細胞的程序化細胞死亡因子5表達〔J〕.中國糖尿病雜志，2008；16(4)：243-6.

7李艷芳，費麗萍，牛青英，等.枸櫞酸預處理對缺血再灌注大鼠室性心律失常及心肌Caspase-3表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(21)：5249-51.

8朵 杰，汪曉洲.芹菜素與老年大鼠缺血心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2017；37(1)：54-6.

9Choudhary R，Bodakhe SH.Magnesium taurate prevents cataractogenesis via restoration of lenticular oxidative damage and ATP ase function in cadmium chloride-induced hypertensive experimental animals〔J〕.Biomed Pharmacother，2016；84：836-44.

10Hedayati Kashka R，Zavareh S，Lashkarbolouki T.Augmenting effect of vitrification on lipid peroxidation in mouse preantral follicle during cultivation：modulation by coenzyme Q10〔J〕.Syst Biol Reprod Med，2016；3：1-11.

11鐘文娟.腦心通聯合雙聯抗栓防治冠脈內微栓塞的動物實驗研究〔D〕.福州：福建醫科大學，2010.

12魏雪梅，朱慶華，谷世奎，等.替格瑞洛在氯吡格雷抵抗急性心肌梗死患者PCI術后抗血小板治療中的應用效果〔J〕.山東醫藥，2015；59(15)：46-8.

13陳逸倫，李晶晶，耿曉雯，等.氯吡格雷對冠心病合并慢性腎病患者抑制血小板聚集作用的影響〔J〕.中國循環雜志，2015；30(7)：647-9.

14肖祖華，鐘德福，丁富蓮，等.心可舒聯合氯吡格雷治療不穩定型心絞痛的療效觀察〔J〕.臨床醫學工程，2015；22(5)：588-9.

〔2016-12-11修回〕

(編輯 苑云杰)

福建省衛生計生青年科研課題(No.2016-1-67)

許朝祥(1970-)，男，碩士，主任醫師，主要從事心血管疾病研究。

徐 玲(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事心血管疾病研究。

R363

A

1005-9202(2017)16-3942-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.015