敦煌石室大寶膠囊對(duì)衰老大鼠血清白細(xì)胞介素-4、-10含量和海馬區(qū)熱休克蛋白86基因蛋白表達(dá)的影響

段云燕 杜 娟 段永強(qiáng) 梁麗娟 楊曉軼 梁玉杰 成映霞 朱立鳴 雒 軍

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020)

敦煌石室大寶膠囊對(duì)衰老大鼠血清白細(xì)胞介素-4、-10含量和海馬區(qū)熱休克蛋白86基因蛋白表達(dá)的影響

段云燕 杜 娟 段永強(qiáng) 梁麗娟1楊曉軼 梁玉杰1成映霞 朱立鳴 雒 軍

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020)

目的觀察以健脾補(bǔ)腎-滌痰祛瘀法為指導(dǎo)的敦煌石室大寶膠囊(DHDB)對(duì)衰老模型大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-10含量和海馬區(qū)熱休克蛋白(HSP)86基因和蛋白表達(dá)的影響。方法受試動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組(n=10)和模型組(n=50)。采用D-半乳糖(0.125 g/kg)皮下注射建立衰老模型并篩選符合衰老模型的大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、DHDB高、中、低劑量組(0.8、0.4、0.2 g/kg)和陽(yáng)性對(duì)照組(0.4 g/kg吡拉西坦)，經(jīng)藥物干預(yù)后分別測(cè)定各組大鼠血清IL-4、IL-10含量和海馬區(qū)HSP86基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠學(xué)習(xí)能力下降，血清IL-4含量顯著降低、IL-10含量顯著增高，海馬區(qū)HSP86基因和蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)；DHDB各劑量組大鼠學(xué)習(xí)能力提高，血清IL-4含量顯著增高而IL-10含量顯著降低，海馬區(qū)HSP86基因和蛋白表達(dá)水平顯著增高，且以高劑量DHDB作用為優(yōu)(P<0.05)。結(jié)論DHDB具有提高衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，調(diào)節(jié)血清IL-4、IL-10含量正常分泌及促進(jìn)海馬區(qū)HSP86基因和蛋白表達(dá)的作用。

白細(xì)胞介素-4；白細(xì)胞介素-10；熱休克蛋白86；腦海馬組織；敦煌石室大寶膠囊；衰老

目前，應(yīng)用中醫(yī)藥防治老年癡呆具有一定的優(yōu)勢(shì)。研究表明，敦煌石室大寶膠囊(DHDB)可通過調(diào)節(jié)衰老大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、三磷酸腺苷酶活性以及鈣穩(wěn)態(tài)等改善腦功能〔1，2〕。本課題擬探討DHDB對(duì)衰老大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-4/IL-10含量和海馬區(qū)熱休克蛋白(HSP)86基因蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、藥物、儀器及試劑 SPF級(jí)Wistar大鼠，3月齡，雌雄各半，體重180～220 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001-0096；SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證：SYXK(甘)2011-0001-00000119。DHDB(甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，甘藥制字Z04010872，0.45 g/粒，批號(hào)130420)；陽(yáng)性對(duì)照藥(吡拉西坦片，黑龍江百泰藥業(yè)有限公司，批號(hào)120805)。Y型水迷宮，甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心自制；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(規(guī)格型號(hào)：BENCHMARK PULS，美國(guó)BIO-RAD)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(規(guī)格型號(hào)：L-303，金壇市恒豐儀器廠生產(chǎn))。D-半乳糖(北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)1205A0510)；IL-4、IL-10測(cè)試盒，批號(hào)：130450145，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，批號(hào)ZB-2301，北京中杉金橋生物科技有限公司；HSP86、β-actin引物：寶生物工程(大連)有限公司；Trizol 試劑(批號(hào)AK7208-1)、反轉(zhuǎn)錄及Real Time qPCR試劑盒(批號(hào)0000036802)均購(gòu)自Promega Corporation；抗HSP86抗體(批號(hào)B4169)：美國(guó)ImmunoWay公司。

1.2動(dòng)物分組 受試動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，通過水迷宮學(xué)習(xí)能力評(píng)估篩選60只大鼠并按體重編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只為空白組，其余50只大鼠按文獻(xiàn)〔3〕造模。所有動(dòng)物在統(tǒng)一條件下(室溫18℃，相對(duì)濕度30% 左右)以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3造模與給藥 采用每日給予造模大鼠頸部皮下注射D-半乳糖(0.125 g/kg)，連續(xù)注射6 w，造成擬亞急性大鼠衰老模型，模型建立成功后用跳臺(tái)法篩選符合衰老行為標(biāo)準(zhǔn)大鼠，再將模型動(dòng)物按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、DHDB高、中、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。并給予DHDB灌胃治療，等效劑量以成人常規(guī)劑量按人與動(dòng)物體型系數(shù)折算〔4〕：即DHDB高、中、低劑量組給予0.8，0.4和0.2 g·kg-1·d-1DHDB藥劑灌胃(相當(dāng)于成人劑量的10、5和2倍)；給予陽(yáng)性對(duì)照組0.4 g·kg-1·d-1吡拉西坦片藥劑灌胃(相當(dāng)于成人劑量的5倍)。各組均以蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，連續(xù)灌胃40 d，給藥容積為1 ml/100 g體重，因灌胃操作不當(dāng)，模型組和DHDB低劑量組各死亡2只大鼠，DHDB高、中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組各死亡1只大鼠。

1.4各組大鼠學(xué)習(xí)能力評(píng)估〔3〕受試大鼠處理第41天后開始進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)能力訓(xùn)練，大鼠進(jìn)入水臂直接游至安全臂停靠臺(tái)為正確，反之進(jìn)入另一臂則為錯(cuò)誤。學(xué)習(xí)能力以達(dá)到連續(xù)9次正確所需的次數(shù)為指標(biāo)，超過30次則記為30，并記錄每次達(dá)到安全臺(tái)所需的時(shí)間作為潛伏時(shí)間。連續(xù)訓(xùn)練5 d，訓(xùn)練結(jié)束后間隔1 d，即第47天進(jìn)行記憶能力測(cè)試，記憶能力以15次中正確的次數(shù)為指標(biāo)，并記錄每次的潛伏時(shí)間。

1.5組織取材與標(biāo)本制備 各組動(dòng)物于記憶能力測(cè)試結(jié)束后，3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)將大鼠麻醉，股動(dòng)脈取血后斷頭處死，血清標(biāo)本制備：大鼠股動(dòng)脈采血4 ml，37℃水中放置30 min，以3 000 r/min離心10 min，分離血清4℃冰箱保存，待測(cè)效應(yīng)指標(biāo)。腦組織常規(guī)固定和勻漿制備：采血處死后低溫條件下快速取出腦組織，一部分腦組織置入4%多聚甲醛中固定后制作病理切片待免疫組化檢測(cè)HSP86蛋白備用。腦海馬組織的收集：大鼠處死后迅速將腦海馬組織定位取出后置于用DEPC處理過的凍存管中，于-80℃冷凍保存待測(cè)HSP86 基因表達(dá)備用。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腦海馬區(qū)HSP86基因表達(dá)水平 取適量腦組織，用Trizol 試劑提取腦組織總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書操作步驟，獲得cDNA 產(chǎn)物，并進(jìn)行PCR反應(yīng)，β-actin 為內(nèi)參。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以β-actin作為內(nèi)參基因，相同模板相同基因設(shè)3復(fù)孔、6次平行實(shí)驗(yàn)，得到各擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值。反應(yīng)體系據(jù)GoTaq 2-Step RT-qPCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)說(shuō)明書配制。β-actin引物序列：上游序列5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游序列5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為150 bp；HSP86引物序列為：上游5′-CTGACAGAATGACAAGTCTGTGAA-3′，下游5′-CAGTTACAGCAGCACTGGTATCATC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為162 bp。反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循環(huán)40次，終末延伸65 ℃、5 s，95 ℃ 15s。連續(xù)檢測(cè)熒光并記錄擴(kuò)增曲線，采用樣點(diǎn)擬合法分析結(jié)果得到目的基因和β-actin的Ct值，并用比較Ct值法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量：ΔΔCt=(測(cè)試組目的基因Ct值-測(cè)試組內(nèi)參基因Ct值)-(對(duì)照組目的基因Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值)，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.7免疫組化法檢測(cè)腦海馬區(qū)HSP86蛋白表達(dá)水平 腦組織塊浸于4%多聚甲醛中固定后，經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做連續(xù)切片，片厚4 μm。取各大鼠等部位切片3張，經(jīng)二甲苯二級(jí)脫蠟各5 min，梯度酒精脫水，高壓熱修復(fù)后分別滴加1∶100比例稀釋的兔抗大鼠HSP86一抗4℃過夜，次晨取出置常溫，PBS緩沖液沖洗后，滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB顯色，水沖洗后蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽(yáng)性細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)黃染。應(yīng)用 BI-2000 多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化切片進(jìn)行圖像分析，每個(gè)部位取5個(gè)視野，分別測(cè)量同一視野中反映免疫反應(yīng)物陽(yáng)性強(qiáng)度的平均光密度、分布密度數(shù)值并以平均數(shù)進(jìn)行分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行F及q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)能力及學(xué)習(xí)潛伏時(shí)間比較 與空白組比較，模型組大鼠的9次正確所需次數(shù)顯著升高，學(xué)習(xí)潛伏時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；與模型組比較，DHDB高、中、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠9次正確所需次數(shù)顯著降低，學(xué)習(xí)潛伏時(shí)間顯著縮短，以DHDB高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組作用顯著(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2各組大鼠血清IL-4和IL-10含量比較 與空白組比較，模型組大鼠血清IL-4含量顯著降低，而IL-10含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，DHDB高、中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清IL-4含量顯著升高，IL-10含量顯著降低，以DHDB高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組作用顯著(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)能力及學(xué)習(xí)潛伏時(shí)間比較 (±s)

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

表2 各組大鼠血清IL-4和IL-10含量比較(±s,pg/ml)

2.3各組大鼠腦海馬組織HSP86基因表達(dá)水平比較 與空白組(1.00)比較，模型組大鼠腦組織HSP86基因表達(dá)顯著降低(0.79±0.052，P<0.01)；與模型組比較，DHDB高、中劑量組(0.91±0.047、0.82±0.060)和陽(yáng)性對(duì)照組(0.88±0.057)大鼠腦組織HSP86基因表達(dá)顯著升高，以DHDB高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組作用顯著(P<0.05)。DHDB低劑量組(0.80±0.084)與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.4各組大鼠腦海馬組織HSP86蛋白表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組大鼠腦組織HSP86蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，與模型組比較，DHDB高、中、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組可提高腦組織HSP86蛋白表達(dá)水平，且以DHDB高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組作用顯著(P<0.05，P<0.01)。見表3，圖1。

表3 各組大鼠腦海馬組織HSP86蛋白表達(dá)水平比較(±s,n=6)

圖1 各組大鼠腦海馬組織HSP86蛋白表達(dá)(DAB，×400)

3 討 論

多年來(lái)中醫(yī)藥領(lǐng)域關(guān)于防治阿爾茨海默病(AD)的研究不斷深入，尤其是中醫(yī)藥在改善癥狀、提高生活質(zhì)量等方面已體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)〔4，5〕。中醫(yī)學(xué)在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中，結(jié)合歷代醫(yī)家關(guān)于衰老的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)歸納出“五臟虛衰，痰瘀內(nèi)阻”是發(fā)生AD的主要病因病機(jī)之一，尤其以“脾腎兩虛，痰瘀內(nèi)阻”為主〔6〕，此如《三因極一病證方論·健忘證治》所云：“今脾受病，則意念不清，心神不寧，使人健忘，盡心力思量不者，是也”；另如《醫(yī)方集解·補(bǔ)養(yǎng)之劑》云：“人之精與志皆藏于腎，腎精不足則志氣衰，不能上通于心……迷惑善忘也”，故“健脾補(bǔ)腎、滌痰祛瘀”法已成為臨床防治AD的主要法則之一。本課題所研究的中藥制劑DHDB是挖掘敦煌醫(yī)學(xué)古醫(yī)方學(xué)術(shù)精粹并結(jié)合名老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)化裁而成，由熟地、黃芪、當(dāng)歸、茯苓、大黃、三七等藥物經(jīng)過提取、分離而成，具有強(qiáng)腎填精、健脾益氣、滌痰祛瘀、安和五臟的功效。前期研究表明〔7，8〕DHDB不但可調(diào)節(jié)衰老大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)以及鈣穩(wěn)態(tài)等改善腦功能，還可能夠通過降低衰老大鼠腦組織單胺氧化酶B 型活性，提高三磷酸腺苷酶活性而保護(hù)腦細(xì)胞的功能。目前認(rèn)為增齡性衰老或癡呆等老年認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制亦系多因性、綜合性及復(fù)雜性病理過程〔9〕，近年又強(qiáng)調(diào)炎性衰老、促炎/抗炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，最終可引起機(jī)體衰老加速〔10〕。研究表明〔11〕抗炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)對(duì)炎性細(xì)胞因子有拮抗作用并形成動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體的炎性功能正常，如該動(dòng)態(tài)平衡被破壞，將導(dǎo)致促炎反應(yīng)狀態(tài)增齡性升高，導(dǎo)致炎性衰老的發(fā)生與發(fā)展，同時(shí)炎性衰老和免疫衰老可互為因果，相互作用，形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步加重增齡性疾病發(fā)生發(fā)展。在細(xì)胞因子中，IL-4主要由活化的T細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生，能抑制炎癥因子的產(chǎn)生，從而參與緩解炎癥過程及某些自身免疫疾病的發(fā)生。IL-10主要由Treg細(xì)胞分泌，后者在免疫反應(yīng)中主要發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，而且IL-10可聯(lián)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β產(chǎn)生廣泛的非特異性抑炎作用，還可通過接觸抑制Th1、Th2型免疫反應(yīng)；研究表明〔12〕在衰老過程中，可能存在著一定的調(diào)節(jié)機(jī)制促進(jìn)IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子表達(dá)并參與免疫衰老的發(fā)生。同時(shí)有研究表明在細(xì)胞抗衰老過程中，分子伴侶亦起著重要作用〔13，14〕，其中分子伴侶HSP86在腦衰老中的作用主要包括以下作用〔15，16〕：其一是發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，如細(xì)胞產(chǎn)生的HSPs可以增強(qiáng)其對(duì)損害的耐受程度，維持細(xì)胞的正常功能代謝；其二是參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，HSPs對(duì)氧化應(yīng)激、熱休克、電離輻射等引起的凋亡具有保護(hù)作用；其三是抗氧化應(yīng)激作用，增加HSPs可以提高氧化損傷蛋白的修復(fù)功能，從而保護(hù)氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。本研究結(jié)果顯示DHDB具有促進(jìn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、調(diào)整細(xì)胞因子IL-4/IL-10正常分泌以及上調(diào)HSP86基因和蛋白表達(dá)進(jìn)而提高腦組織細(xì)胞保護(hù)和損傷耐受的作用。

1程 容，段永強(qiáng)，成映霞，等.敦煌石室大寶膠囊對(duì)衰老大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(4)：478-80.

2程 容，段永強(qiáng)，成映霞，等.敦煌石室大寶膠囊對(duì)衰老大鼠腦組織鈣穩(wěn)態(tài)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(23)：3514-6.

3陳 勤.抗衰老研究實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1996：94.

4苗明三.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)〔M〕.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1997：142.

5梁健芬，覃 翠，楊 波.阿爾茨海默病分期與中醫(yī)辨治〔J〕.山東中醫(yī)雜志，2010;29(1)：6-7.

6孫國(guó)珺，顧 耘，黃 凱，等.阿爾茨海默病中醫(yī)證候研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014;32(7)：1566-8.

7段永強(qiáng)，程 容，成映霞，等.敦煌石室大寶膠囊對(duì)衰老大鼠血清MDA 含量、SOD和腦組織GSH-Px活性的影響〔J〕.蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005;31(2)：20-1.

8段永強(qiáng)，成映霞，梁玉杰，等.敦煌石室大寶膠囊對(duì)衰老大鼠腦組織MAO-B、Na+-K+-ATP酶活性的影響〔J〕.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005;22(3)：26-9.

9馬永興，俞卓偉.現(xiàn)代癡呆學(xué)〔M〕.北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2008：274-318.

10馬 英，曹云鵬.阿爾茨海默病的神經(jīng)免疫炎癥發(fā)病機(jī)制及其治療研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(21)：3200-4.

11俞卓偉，保志軍，馬永興.促炎/抗炎細(xì)胞因子與衰老、認(rèn)知障礙的關(guān)系及其干預(yù)作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(11)：2129-31.

12趙 毅，王 燕，劉吉貞，等.轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和IL-10、TGF-β在小鼠衰老過程中的變化規(guī)律〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2010;26(9)：842-5.

13Kenzo O，Tatsuo S.Roles of molecular chaperones in the nervous system〔J〕.Brain Res Bull，2000；53(2)：141-3.

14Csaba S，Peter C.Chaperones and aging：role in neuro-degeneration and in other civilizational diseases〔J〕.Neurochem Int，2002;41(6)：383-5.

15Csaba S，Peter C.Aging and molecular chaperones〔J〕.Exp Gerontol,2003;38(10)：1037-8.

16Poon HF，Castegna A，F(xiàn)arr SA，etal.Quantitative proteomics analysis of specific protein expression and oxidative modification in aged senescence accelerated prone 8 mice brain〔J〕.Neuroscience，2004；126(4)：915-6.

〔2016-05-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(No.DHYX1213-009)；甘肅省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2GS064-A43-020-22)；蘭州市科技局計(jì)劃項(xiàng)目(No.06-2-87)

段永強(qiáng)(1974-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治老年病、脾胃病研究。

段云燕(1972-)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥方劑配伍規(guī)律和脾胃病教學(xué)研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)16-3945-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.016

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)新工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室