小鼠食管癌前病變組織P53表達及化濁潤燥降氣方的干預作用

范煥芳 黃 茂 單保恩 王 玲 韓長輝

(河北省中醫院腫瘤二科，河北 石家莊 050011)

小鼠食管癌前病變組織P53表達及化濁潤燥降氣方的干預作用

范煥芳 黃 茂1單保恩2王 玲2韓長輝

(河北省中醫院腫瘤二科，河北 石家莊 050011)

目的觀察小鼠食管癌前病變組織P53的表達及中藥復方化濁潤燥降氣方的干預作用。方法將130只小鼠分為正常組、模型組、陽性對照組、中藥預防組、中藥治療組，采用4-硝基喹啉-氧化物(4-NQO)制備小鼠食管癌前病變模型，采用流式細胞檢測、免疫組織化學方法觀察各組食管組織中P53的表達。結果14 w末食管癌前病變模型成功。流式細胞檢測：模型組小鼠P53表達水平與正常組相比明顯升高(P<0.05)；陽性對照組、中藥預防組、中藥治療組P53較模型組明顯降低(P<0.05)；中藥預防組與陽性對照組P53表達無明顯差異(P>0.05)；中藥預防組P53表達明顯低于中藥治療組(P<0.05)。免疫組織化學檢測示陽性對照組與模型組P53表達無明顯差異(P>0.05)；中藥預防組、中藥治療組分別與模型組及陽性對照組明顯降低(P<0.05)；中藥預防組低于中藥治療組(P<0.05)。結論小鼠食管癌前病變組織存在P53高表達。化濁潤燥降氣方能降低食管癌前病變小鼠P53的表達。

食管癌前病變；化濁潤燥降氣方；4-硝基喹啉-氧化物；P53

我國是食管癌高發國家，發病率為22.14/10萬，居各類惡性腫瘤第5位，死亡率為16.77/10萬，居第4位〔1〕，5年總生存率低于20%〔2〕。食管中度和重度不典型增生是食管癌變過程中的必經階段，逆轉食管癌前病變向正常細胞分化具有重要意義。P53是與人類腫瘤相關性最高的基因。本文觀察小鼠食管癌前病變組織P53的表達及化濁潤燥降氣方的干預作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取清潔級健康SPF級C57BL/6小鼠130只，雌雄各半，4周齡，體重17～20 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2藥物制備：造模藥物4-硝基喹啉一氧化物(4-NQO)購自Sigma公司。將1 g 4-NQO溶于50 ml蒸餾水，配成濃度為2%的稀釋液，4℃冰箱避光保存。使用時取0.5 ml 2%原液加入100 ml飲用水中，配成100 μg/ml濃度。每100 g小鼠每日用4-NQO 2 500 μg，即口服25 ml含有4-NQO的飲用水。陽性對照組藥物全反式維甲酸(ATRA)(購自Sigma 公司)。使用時將30 mg ATRA 溶于20 ml稀釋后的甲基纖維素中，每20 g小鼠每次灌胃劑量為0.15 mg，每周3次。化濁潤燥降氣方：組成：丹參、沙參、郁金、砂仁、荷葉、茯苓、浙貝母、藿香、佩蘭、冬凌草、全蝎。由河北省中醫院藥學部提供，每付中藥生藥含量131 g，免煎顆粒為13.7 g，小鼠用量與人用量的比例為0.002 6∶1，每20 g小鼠服用0.2 ml含有中藥的水溶液。

1.3主要試劑及儀器 兔抗P53多克隆抗體(Santa Cruz公司)；免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(北京中杉金橋生物有限公司)；Epics-XLⅡ型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.4分組及模型制備 采用隨機分組的方法將130只小鼠分為正常組、模型組、陽性對照組、中藥預防組、中藥治療組，正常組、陽性對照組各20只，其余每組30只。各組雌雄小鼠數目無明顯差異，雌雄分籠。正常組常規飼養，不做特殊處理。其余110只小鼠，每日飲用100 μg/ml的4-NQO水溶液，正常喂養飼料。中藥預防組在開始造模同時給予化濁潤燥降氣方灌胃，每周3次，劑量為20 g小鼠服用0.2 ml濃縮中藥免煎顆粒。各組小鼠在給藥期間每周測體重一次，根據體重調整給藥劑量。14 w末癌前病變模型成功，小鼠停用4-NQO水溶液。之后模型組常規飼養；陽性對照組小鼠開始給予ATRA，劑量為每20 g每次灌胃劑量為0.15 mg，每周3次；中藥預防組小鼠繼續給予化濁潤燥降氣方灌胃，劑量如前；中藥治療組小鼠在模型制備成功時開始給予化濁潤燥降氣方灌胃，用量同預防組。24 w末模型組5只小鼠食管上皮均有癌變，全部處死小鼠，取食管標本，進行各組指標檢測。

1.5流式細胞術測定各組小鼠P53的表達 制備單細胞懸液，取單細胞懸液1×106/ml 0.1 ml，加入鼠抗人單克隆抗體工作液 0.1 ml，室溫孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)10 ml洗滌一次，棄上清，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光、室溫孵育30 min，加入PBS 10 ml離心同上，棄上清以除去未結合的熒光二抗，上機檢測前加入PBS 0.1 ml經500目銅網過濾后上機檢測。以x-mode值作為統計量。

1.6免疫組織化學 免疫組織化學SP法檢測食管上皮組織P53蛋白表達。將食管組織脫蠟和水化，PBS沖洗，滴加一抗，滴加生物素二抗工作液，滴加辣根過氧化物酶-鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min。DAB顯色：蒸餾水洗，蘇木素復染；透明；中性樹脂50 μl封片，室溫保存。采用HMIAS-2000高清晰度彩色分析系統。每組選6張切片，每張切片測10個區域，對每個區域進行平均光度值測定。

1.7統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1流式細胞術檢測各組食管上皮組織P53表達變化 正常組P53 x-mode值為(4.23±0.55)；模型組(25.43±2.94)較正常組明顯升高(P<0.05)；陽性對照組、中藥預防組、中藥治療組P53表達水平分別為(8.85±1.76)、(7.23±0.72)、(11.40±2.03)，三組均較模型組明顯降低(P<0.05)；中藥預防組與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)；中藥預防組明顯低于中藥治療組(P<0.05)。

2.2免疫組織化學法檢測各組小鼠食管上皮組織中p53蛋白表達變化 P53蛋白主要表達于細胞核和細胞質，其細胞核及細胞質出現黃色顆粒為陽性。正常組P53的平均光度為(0.136±0.015)；模型組(0.208±0.012)較正常組明顯升高(P<0.05)；陽性對照組、中藥預防組、中藥治療組分別為(0.202±0.021)、(0.171±0.008)、(0.193±0.018)，陽性對照組與模型組無明顯差異(P>0.05)；中藥預防組、中藥治療組分別較模型組明顯降低(P<0.05)；中藥預防組、中藥治療組較陽性對照組明顯降低(P<0.05)；中藥預防組顯著低于中藥治療組(P<0.05)，見圖1。

圖1 免疫組織化學法檢測小鼠食管上皮組織P53表達(DAB，×400)

3 討 論

研究表明，食管癌發生與亞硝胺類化合物、吸煙、飲酒、真菌、病毒等外界環境因素影響有關，但更主要的是與其本身的基因改變相關〔3〕。野生型P53基因是人體內功能最強大的抑癌基因，它對細胞周期和凋亡起關鍵性作用。P53基因能夠阻斷一種血管生成基因的表達，抑制腫瘤內部血管形成，有效防止腫瘤的復發、轉移并提高人體自身的免疫功能。另外，P53基因還有修復受損基因的作用。基因受損時P53連接DNA，然后由蛋白質群合力修復受損DNA。如果DNA損傷過度無法修復，P53基因就會誘導細胞進入凋亡狀態。P53基因作為一個重要的抗癌基因調控DNA修復、細胞周期停滯和誘導細胞凋亡，維持基因組和細胞穩定，使癌細胞自殺，防止癌變〔4〕。但是一旦該基因發生突變，導致細胞無節制的分裂，就容易引發癌癥。

黃志軍〔5〕探討食管癌、癌旁組織中P53、MDR-1基因的表達及相關性，結果表明，突變型P53在食管癌、癌旁組織中均呈高水平表達，P53基因突變早于組織形態學改變。任秀花等〔6〕采用免疫組化方法檢測P53蛋白在45例原發性食管鱗癌大體標本中的不同病變區域的表達。結果表明，P53蛋白在食管癌自然病史中呈現漸進性高表達，其在單純增生和不典型增生中表達有明顯性差異，提示P53蛋白基因的改變在食管癌發生的早期就出現了，即發生了基因突變，同時從另一個側面提示在食管癌前病變階段觀察中藥單方或復方的干預作用對于探討中藥的具體作用機制具有重要意義。

食管癌前病變屬“噎膈”范疇〔7〕。啟膈散具有潤燥降氣、開郁化痰的作用，可以治療噎膈輕癥患者。化濁潤燥降氣方是在名方啟膈散的基礎上加化濁通絡解毒之品藿香、 佩蘭、冬凌草、天龍、全蝎而成，全方共奏化濁解毒、化痰解郁、通絡散結之效。本研究結果表明，食管癌前病變小鼠發展為食管癌時存在P53的高表達，化濁潤燥降氣方能夠抑制P53的表達而阻斷食管癌前病變的進展。

1赫 捷,陳萬青.中國腫瘤登記年報〔M〕.北京.軍事醫學科學出版社,2012：28-30.

2Kim T,Grobmyer SR,Smith R,etal.Esophageal cancer:the five year survivors〔J〕.J Surg Oncol,2011;103(2):179-83.

3邰智慧,張 科,李淑英,等.人乳頭瘤病毒感染與不同地域食管癌發生相關性Meta 分析〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(18):4451-3.

4賈春平.抑癌基因P53與腫瘤研究的最新進展〔J〕.生命科學,2008;20(3):450-3.

5黃志軍.食管癌、癌旁組織中P53、MDR-1 基因的表達〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(7):1782-4.

6任秀花,郭 坤,李珊珊,等.食管癌及癌前病變中p53、CD44v6蛋白的表達及其意義〔J〕.河南腫瘤學雜志,2004;17(3):161-2.

7霍炳杰,徐江紅,邢筱華.劉亞嫻教授治療食管癌前病變經驗〔J〕.河北中醫,2011;33(4):488-9.

〔2016-04-17修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省高層次人才資助項目(No.B2012003007)

單保恩(1962-)，男，主任醫師，醫學博士，博士生導師，主要從事惡性腫瘤研究。

范煥芳(1970-)，女，主任醫師，醫學博士，碩士生導師，主要從事惡性腫瘤研究。

R732

A

1005-9202(2017)16-3950-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.018

1 河北省中醫院兒童康復科 2 河北醫科大學第四醫院科研中心