Ki-67在Luminal 型乳腺癌患者中的表達水平及其與臨床病理特征的關系

劉 欣 毛大華

(貴州醫科大學，貴州 貴陽 550025)

Ki-67在Luminal 型乳腺癌患者中的表達水平及其與臨床病理特征的關系

劉 欣 毛大華1

(貴州醫科大學，貴州 貴陽 550025)

目的探討Ki-67在Luminal 型乳腺癌患者中的表達水平與臨床病理的關系。方法選取2012年8月至2014年8月該院62例乳腺癌患者為研究組，并選取同期來該院體檢的30例乳腺增生患者為對照組，采用實時熒光定量RT-PCR法檢測兩組組織及血清中Ki-67的表達，探討Ki-67與臨床病理的相互關系，并通過低表達人乳腺癌細胞系MCF-7中Ki-67后觀察細胞的增殖與遷移能力。結果與對照組比較，乳腺癌患者血清及組織中Ki-67的表達水平均顯著增加(均P<0.05)。Ki-67的mRNA水平在乳腺癌癌組織中的表達水平亦顯著高于對照組(P<0.05)；相關分析結果顯示，Ki-67的高表達與乳腺癌的臨床分期、腫瘤大小及淋巴結轉移呈顯著正相關(均P<0.05)。低表達Ki-67后人乳腺癌細胞系MCF-7中乳腺癌細胞的增殖水平顯著降低，遷移能力顯著減少(均P<0.05)。結論乳腺癌患者體內增加的Ki-67水平可能對乳腺癌的發生發展有著一定的促進作用，其機制可能是通過影響癌細胞的增殖和遷移水平來發揮作用。

Ki-67；乳腺癌；增殖；遷移

目前臨床上將乳腺癌主要分為：Luminal型(激素受體表達腫瘤)、人表皮生長因子受體(HER)2陰型(激素受體陰性)及基底樣型(缺少激素受體及HER2表達)。其中，激素受體陽性型可進一步分為Luminal A型和Luminal B型。在腫瘤發生的病理生理過程中，腫瘤細胞的異常性增殖以及過度遷移是其中最為關鍵的部分。Ki-67 是一種與增殖細胞相關的核抗原，其可表達于除G0期外的所有細胞周期階段，是近年來認為能夠有效判斷細胞增殖活性指數的分子指標〔1〕。研究認為，Ki-67增殖活性高低和乳腺癌的分化程度、浸潤轉移及預后有一定的關系〔2〕，但具體的作用機制尚未明了。本研究旨在分析Ki-67與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關系，并通過低表達人乳腺癌細胞系MCF-7中Ki-67后觀察腫瘤細胞的增殖與遷移能力，探討Ki-67影響乳腺癌的分子機制。

1 資料與方法

1.1臨床資料 所有組織來源于2012年8月至2014年8月貴州醫科大學附屬烏當醫院收治的62例Luminal 型乳腺癌患者。其中Luminal A型28例，Luminal B型34例。患者均為女性，年齡22～57〔平均(43.5±9.2)〕歲，術前未經放、化療治療。于同期隨機選取的30例乳腺增生患者為對照組，年齡24～54〔平均(45.5±11.4)〕歲。本研究根據雌激素受體(ER)和(或)孕激素受體(PR)表達與否，Luminal 型乳腺癌患者的診斷標準：Luminal A型ER(+)和(或)PR(+)且HER-2(-)；Luminal B型ER(+)和(或)PR(+)且HER-2(+)。 兩組性別、年齡等一般情況無顯著差異(均P>0.05)，具有可比性。患者均知情同意。

1.2主要試劑 組織、血清中的RNA通過Trizol試劑盒(Life Technologies)提取；RNA逆轉錄通過cDNA逆轉錄試劑盒(美國PROMEGA公司)進行；PCR試劑盒(南京生興生化科技有限公司)。

1.3逆轉錄反應 清晨空腹時抽取兩組外周靜脈血5 ml，盡快于4℃下4 000 r/min離心5 min。離心后提取上層血清放入-80℃保存備用。研究者于手術中取乳腺癌患者及增生患者組織200 mg進行試驗，在組織中加入1 ml 的Trizol并充分勻漿，并抽提總RNA，并將其溶于30 μl的焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水，采用紫外分光光度計對提取的總RNA進行定量。同時，將獲得的RNA逆轉錄成cDNA，置于-20℃環境下保存留待后用。Ki-67的引物序列參考文獻〔3〕。U6為對照內參。PCR反應條件：95℃變性20 s，60℃ 20 s和70℃ 1 s 50個循環。采用7300型Real-Time PCR儀器(美國ABI公司)進行PCR分析，并以2-ΔΔCt法進行相對定量分析〔4〕，最終結果以相對于對照組的倍數進行描述。

1.4免疫組化及判定標準 取乳腺癌組織標本以10%甲醛固定48 h后，石蠟包埋切片為4 μm切片，用Ki-67抗體(北京中山生物技術有限公司)進行常規S-P免疫組化染色，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，光學顯微鏡觀察棕色的陽性群。細胞核上的棕褐色顆粒計為Ki-67 陽性。參照腫瘤細胞的染色程度和染色反應強度評估免疫組化的染色結果。在高倍視野(蔡司Stemi DV4，×100)下隨機選取 10 個不同的視野進行統計：陽性細胞數<5%為陰性，5%～25%為+：26%～50%為，51%～75%為。陽性率=陽性細胞數/10個視野的細胞數×100%。

1.5細胞轉染 MCF-7細胞(上海研晶生物科技有限公司)采用完全DMEM培養液培養：含不完全DMEM(美國Gibco)10%胎牛血清(美國Gibco)及1%的青鏈霉素(武漢博士德)，以37℃，5% CO2下培養。取對數生長期人乳腺癌細胞系MCF-7細胞，采用脂質體LipofectamineTM2000(上海英駿)對MCF-7中Ki-67進行小RNA干擾，Ki-67的siRNA序列為5′-CCACCAGAGCCAAUAGAUACUUCAG-3′及5′-CUGAAGUAUCUAUUGGCUCUGGUGGUG-3'；對照序列為5′-UCAUAAGUGAUGCUGGAGCTT-3'。用RT-PCR技術驗證轉染效率。

1.6細胞侵襲實驗 調整細胞密度至(3～5)×105個/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上層，小室下層加入1 ml 10%血清的培養液。培養24 h時間后，取出transwell小室，吸去上層的培養基，終止實驗，使小室于室溫下自然干燥。無水乙醇固定后，采用0.1%結晶紫于室溫下染色30 min，倒置顯微鏡(蔡司Axio Observer A1m)下觀察己遷移至小室下層的細胞。隨機選取5個視野后計數小室下層的細胞數目。

1.7細胞增殖實驗 MCF-7細胞轉染siRNA 對照序列及siRNA Ki-67干擾序列后的0、24、48、72 h每孔按1∶10體積比混合無血清必需基本培養基 DMEM 和膽囊收縮素(CCK)-8(Cell signaling)，采用分光光度計于450 nm波長(上海美譜達，型號 UV-3100)測定每孔OD值，并制作細胞生長曲線，本實驗每樣5復孔，重復3次。

1.8統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t、χ2檢驗、秩和檢驗和Spearman分析法。

2 結 果

2.1乳腺癌患者血清及組織中Ki-67蛋白水平比較 Ki-67在乳腺癌患者血清組織中的mRNA表達水平(3.18±0.62，3.61±0.54)顯著高于對照組(1.05±0.14，1.04±0.11)(t=25.729，36.104；均P=0.000)。

2.2Ki-67在不同組織病理型乳腺癌中的表達 參照 AJCC乳腺癌TNM分期，Ⅰ期 11例，Ⅱ期20 例，Ⅲ期31例；Spearman 相關分析結果顯示乳腺癌組織Ki-67表達強度與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移個數呈正相關 (P<0.05)。見表1。

2.3低表達水平與乳腺癌細胞增殖及侵襲的影響 MCF-7細胞低表達48 h后，MCF-7細胞中Ki-67 mRNA表達水平顯著降低；此外，低表達Ki-67的乳腺癌細胞的增殖水平顯著增加，48 h及72 h時的組間差異有統計學意義(P<0.05)；低表達Ki-67的乳腺癌細胞的遷移能力減少(P<0.05)。見表2。

表1 Ki-67表達與乳腺癌TNM分期、腫瘤大小及淋巴結轉移的關系(n)

1)有2例無淋巴結轉移

表2 低表達水平與乳腺癌細胞增殖及侵襲的影響(±s,n=5)

與Blank組比較：1)P<0.05，與Control組比較：2)P<0.05；與0 h時點比較：3)P<0.05

3 討 論

乳腺癌在我國的某些地區發病率已上升為女性惡性腫瘤的第一位，乳腺癌的發病率呈逐年增加，并且有年齡年輕化的趨勢。惡性腫瘤最為重要的生物學特性為侵襲轉移，同時也是引起乳腺癌患者死亡的主要原因〔4〕，然而，其具體的致病過程和病理學機制尚不完全清楚。研究表明，Ki-67是一種定位于第 10 號染色體上的基因，可以識別增殖細胞核基質內的核蛋白，起作用主要與細胞的有絲分裂密切關聯，尤其與腫瘤細胞的增殖息息相關〔4～6〕。然而，關于Ki-67與Luminal 型乳腺癌之間的關系，其在乳腺癌發病機制中的作用，目前相關的研究相對較少。

本研究結果提示Ki-67可能與乳腺癌的發生、發展密切相關。Warth等〔7〕在非小細胞肺癌患者體內發現Ki-67表達水平增加，并且可以作為預測指標；Pollack等〔8〕和Khor等〔9〕在前列腺癌患者體內亦發現Ki-67表達顯著增加；此外，Inwald等〔10〕在乳腺癌患者體內發現Ki-67表達顯著增加，并且可以作為預測乳腺癌發病的指標。本研究結果提示Ki-67的高表達參與了乳腺癌的發生發展過程，進一步說明Ki-67在乳腺癌組織中發揮重要的促進腫瘤形成及轉移的作用。研究還發現，低表達膀胱癌細胞中Ki-67水平后能夠抑制腫瘤的生長〔11〕。本研究結果說明了Ki-67可能影響通過調節癌細胞的增殖水平影響著乳腺癌患者體內癌細胞的惡性程度。

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3Arjonen A，Kaukonen R，Mattila E，etal.Mutant p53-associated myosin-X upregulation promotes breast cancer invasion and metastasis〔J〕.J Clin Invest，2014；124(3)：1069-82.

4Beresford MJ，Wilson GD，Makris A.Measuring proliferation in breast cancer：practicalities and applications〔J〕.Breast Cancer Res，2006；8(6)：216.

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7Warth A，Cortis J，Soltermann A，etal.Tumour cell proliferation(Ki-67)in non-small cell lung cancer：a critical reappraisal of its prognostic role〔J〕.Br J Cancer，2014；111(6)：1222-9.

8Pollack A，DeSilvio M，Khor LY，etal.Ki-67 staining is a strong predictor of distant metastasis and mortality for men with prostate cancer treated with radiotherapy plus androgen deprivation：Radiation Therapy Oncology Group Trial 92-02〔J〕.J Clin Oncol，2004；22(11)：2133-40.

9Khor LY，Bae K，Paulus R，etal.MDM2 and Ki-67 predict for distant metastasis and mortality in men treated with radiotherapy and androgen deprivation for prostate cancer：RTOG 92-02〔J〕.J Clin Oncol，2009；27(19)：3177-84.

10Inwald EC，Klinkhammer-Schalke M，Hofstadter F，etal.Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients：results of a large population-based cohort of a cancer registry〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2013；139(2)：539-52.

11Pichu S，Krishnamoorthy S，Shishkov A，etal.Knockdown of Ki-67 by dicer-substrate small interfering RNA sensitizes bladder cancer cells to curcumin-induced tumor inhibition〔J〕.PLoS One，2012；7(11)：e48567.

〔2016-10-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

毛大華(1964-)，男，副主任醫師，主要從事乳腺腫瘤研究。

劉 欣(1983-)，男，主治醫師，主要從事乳腺腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)16-3954-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.020

1 貴州醫科大學附屬烏當醫院乳腺外科