人參皂苷Rh2誘導口腔鱗癌耐藥細胞凋亡

徐亞娟 金志巍 劉莉莉 劉文書

(吉林省腫瘤醫院口腔頜面腫瘤外科，吉林 長春 130012)

人參皂苷Rh2誘導口腔鱗癌耐藥細胞凋亡

徐亞娟 金志巍 劉莉莉 劉文書1

(吉林省腫瘤醫院口腔頜面腫瘤外科，吉林 長春 130012)

目的探討人參皂苷Rh2對口腔鱗癌耐藥細胞(KBV)的促凋亡作用及其對時間和劑量的時效量效關系。方法采用MTT法檢測人參皂苷Rh2于不同時間和濃度下對KBV的生長抑制作用及藥物毒性實驗；通過臺盼藍染色進一步檢測Rh2不同濃度和時間下誘導KBV的死亡率；利用提取Rh2作用后DNA進行瓊脂糖凝膠電泳觀察KBV細胞基因組降解情況。結果48 h內，KBV細胞在0～100 μg/ml的Rh2誘導下，其所導致的生長抑制率隨著時量和劑量的增加而有所加強，對正常細胞的抑制率均在10%以下并且臺盼藍染色得到的死亡率不超過12%，細胞DNA在人參皂苷Rh2作用后發生降解，瓊脂糖電泳呈梯形條帶。結論人參皂苷Rh2是一種安全有效毒副作用小的藥物，其對KBV的抑制作用主要由凋亡引起，并隨著濃度和時間的不斷增加，持續作用于耐藥癌細胞。

口腔鱗癌細胞;耐藥性;凋亡;Rh2

口腔鱗癌在口腔頜面部的惡性腫瘤中占較高比重，常用的臨床治療手段包括手術、化學、放射和靶向治療等，其中化學治療是術后最常用的輔助治療手段，但現有臨床藥物大多毒副作用較高，且長期使用過程中，細胞耐藥性使化療效果大大減弱〔1〕。這種現象是由于P-糖蛋白、耐藥性相關蛋白及凋亡抑制基因等表達所引起〔2〕。據美國癌癥協會調查，不同程度的耐藥會導致90%以上的癌癥患者死亡〔3〕。人參皂苷Rh2在腫瘤治療方面安全有效，不僅具有促凋亡、抑生長、防轉移等能力〔4〕；可殺傷膽囊癌、腸癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞〔5～7〕；且對于乳腺癌、肺癌及肝癌等因化學藥物產生的耐藥性發生逆轉作用〔8～12〕，能夠通過誘導凋亡作用于P-糖蛋白介導的耐藥現象〔13〕。但目前人參皂苷Rh2單體對口腔鱗癌耐藥細胞(KBV)的凋亡作用及其對劑量和濃度的時效量效關系尚未見有關報道。本實驗主要采用經順鉑誘導KBV經Rh2作用后，分別通過檢測藥物于不同時間與濃度的生長抑制率和細胞死亡率，同時鑒定細胞DNA片段，為人參皂苷Rh2誘導腫瘤細胞凋亡研究提供重要數據。

1 材料與方法

1.1材料 人永生化上皮細胞(HaCaT)和人口腔鱗癌細胞(KB)由吉林省腫瘤醫院供應。人參單體Rh2由長春理工大學生命學院提供。細胞基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產品。曲利苯蘭(臺盼藍)、四甲基偶氮唑藍(MTT)由北京鼎國昌盛有限責任公司提供。RPMI-1640細胞培養干粉購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1KBV制備 通過梯度濃度(1、2、3、4、5、6 μg/ml)的順鉑誘導KB，用正常和加藥的完全RPMI-1640于37℃、5%CO2條件下間隔培養至耐藥6 μg/ml。6個月后，將口腔鱗癌及耐藥細胞按每孔6×103個接種于96孔細胞培養板，150 μl/孔細胞懸液貼壁后，加100 μl的1～6 μg/ml濃度梯度順鉑，設3個副孔。培養48 h后棄上清，加20 μl MTT在避光條件下于培養箱中4 h后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)低速搖床10 min，酶標儀波長設置為490 nm檢測OD值計算細胞活性。

1.2.2MTT法檢測細胞生長抑制率 取對數生長期的KBV和人永生化上皮細胞HaCaT，用胰蛋白酶消化后，用完全培養液調成濃度為6×103/ml的單細胞懸液，上述方法鋪板，每孔中添加100 μl含梯度濃度Rh2單體和5-氟尿嘧啶(0、20、40、60、80、100 μg/ml)的完全培養液，每個濃度設3個復孔培養12、24、48 h。重復上述MTT測定過程檢測細胞活性計算不同時間與濃度下的生長抑制率。

1.2.3臺盼藍染色鑒定細胞死亡情況 分別取加藥后12、24和48 h的KBV，胰酶消化重懸后按照9∶1的比例與0.4%的臺盼藍染液均勻混合，在室溫下染色3 min后置于顯微鏡下觀察細胞染色情況，計算5-氟尿嘧啶和Rh2誘導細胞死亡率。

1.2.4瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段 取對數生長期的KBV，加入不同質量濃度的Rh2(20、40、60、80、100 μg/ml)，12 h后通過提取上藥細胞基因組在制取濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳來觀察DNA片段斷裂情況。

2 結 果

2.1KBV鑒定 在順鉑濃度較低時對細胞活性影響不顯著，而當濃度>2 μg/ml時，正常癌細胞死亡率增高對順鉑無耐受性，而耐藥細胞活性略有降低但仍高于KB細胞，KBV對于順鉑的耐受性明顯高于KB細胞。見圖1。

圖1 梯度濃度順鉑對KB及KBV細胞活性的影響

2.2人參皂苷Rh2對KBV細胞的抑制率測定 設5-氟尿嘧啶為陽性、完全培養基為空白對照，Rh2與5-氟尿嘧啶對KBV均有抑制作用，同時其效果隨著濃度與時間的加強而逐漸增強。其中5-氟尿嘧啶在24 h內作用速度快殺傷力強，24～48 h作用減弱，效果弱于初期，而人參皂苷Rh2在48 h內對KBV作用速度增加穩定，緩慢作用持續上升。見圖2。

圖2 不同濃度和時間下Rh2、5-氟尿嘧啶對KBV細胞的生長抑制作用

2.3人參皂苷Rh2對正常細胞毒性檢測 Rh2作用于HaCaT細胞的48 h內，細胞的生長抑制率雖有所增加，但均不超過10%，且不隨著濃度升高而增加，而相同時間內5-氟尿嘧啶對細胞生長抑制率不斷增長，均大于41%，遠高于Rh2對細胞的生長抑制作用。見圖3。

圖3 不同濃度和時間下藥物對HaCaT細胞的生長抑制作用

2.4瓊脂糖電泳檢測細胞凋亡 圖4結果顯示，12 h時細胞DNA已開始降解，在20和40 μg/ml降解現象不明顯，隨著藥物的濃度的上升，在60～100 μg/ml的Rh2作用下，細胞基因組DNA片段化逐漸明顯，可觀察到明顯梯形條帶，證實細胞凋亡現象產生。

2.5細胞死亡率檢測 5-氟尿嘧啶在48 h內所引起的細胞死亡率要遠高于Rh2，且隨著濃度和時間正向延伸，5-氟尿嘧啶的死亡率明顯升高，而人參皂苷Rh2較為平緩，由于臺盼藍凋亡小體拒染現象，結合MTT法測定的抑制率證實在藥物對于細胞的抑制過程中，Rh2導致細胞死亡的主要作用在于誘導凋亡，而5-氟尿嘧啶則主要是壞死作用。見表1。

表1 Rh2和5-氟尿嘧啶作用于不同濃度與時間的細胞壞死率

A：100 μg/ml B：80 μg/ml C：60 μg/ml D：40 μg/ml E：20 μg/ml F：0 μg/ml G：Marker圖4 不同濃度Rh2對細胞DNA的降解作用

3 討 論

口腔鱗癌目前仍是威脅人們生命的重大疾病，由于手術極易損傷面部，化療成為治療口腔鱗癌最重要的手段，雖然目前常用的臨床治療藥物順鉑、5-氟尿嘧啶及紫杉醇等雖有較好的治療效果，但毒副作用高和致免疫力低下等可引起許多其他疾病的發生〔13〕，除此外還極易產生耐藥性〔14〕。KBV細胞是以對順鉑較為敏感的KB細胞通過順鉑濃度梯度刺激后誘導而成，其耐藥程度遠高于KB細胞，可作為研究腫瘤細胞耐藥性的良好材料。郗照勇等〔15〕對在研究順鉑耐藥的分子機制的過程中發現，順鉑的耐藥主要是通過抑制凋亡信號傳導和DNA修復損傷、減少藥物累積和增強去活作用等。本實驗結果表明，KBV對順鉑耐受良好，而Rh2在作用于KBV細胞的48 h內，其導致的生長抑制率在實驗范圍內隨著時間與劑量的增加而增加，并且持續作用于KBV的同時，對人體正常細胞傷害極小，證實Rh2是一種安全低毒且在體外對KBV有良好抑制作用的藥物。

細胞凋亡是在基因控制下自主死亡并可穩定內環境的有序過程，不發生炎癥反應，過程中細胞膜保持完整，并在核酸酶作用下發生DNA降解，因此會發生臺盼藍拒染現象和產生200 bp左右整倍數核苷酸片段。本研究中，結合MTT法與臺盼藍染色，發現MTT法得到的生長抑制率要遠高于臺盼藍染色得到的死亡率，證實Rh2導致KBV細胞的主要死亡方式在于凋亡，并通過提取藥物作用于KBV細胞的基因組進行DNA電泳所形成的特異性梯狀條帶，發現KBV從12 h開始出現凋亡，并且隨著藥物濃度的上升，DNA降解越完全。

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〔2017-02-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

劉文書(1966-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事口腔頜面外科研究。

徐亞娟(1965-)，女，主任醫師，主要從事口腔頜面腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)16-3956-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.021

1 吉林大學第一臨床醫院口腔科