ACE和ACE2基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性

王樹越 吳 娟 賈一揚(yáng) 王 琪 孫 迪 徐 縉 陳懷基 許 峰 葉 琳

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院急診科，吉林 長(zhǎng)春 130033)

ACE和ACE2基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性

王樹越 吳 娟1，2賈一揚(yáng)1王 琪1孫 迪1徐 縉1陳懷基1許 峰1葉 琳1

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院急診科，吉林 長(zhǎng)春 130033)

目的探討血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)基因和ACE2基因遺傳變異與中國(guó)北方漢族人群冠心病(CHD)的關(guān)系。方法選擇在吉林大學(xué)第一醫(yī)院確診并住院的246例CHD患者和同期進(jìn)行健康體檢的251例正常人為研究對(duì)象，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)ACE基因rs4461142位點(diǎn)及ACE2基因rs1514283位點(diǎn)的多態(tài)性并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果病例組和對(duì)照組高血壓、糖尿病所占的比例具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；兩組rs4267385位點(diǎn)、rs1514283位點(diǎn)等位基因和基因型頻數(shù)分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論ACE基因rs4267385位點(diǎn)和ACE2基因rs1514283位點(diǎn)可能不是中國(guó)北方漢族人群CHD的易感位點(diǎn)。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ基因；冠心病；基因多態(tài)性

在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中腎素-血管緊張素(Ang)系統(tǒng)(RAS)發(fā)揮重要作用〔1〕。Ang轉(zhuǎn)換酶(ACE)是RAS系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一，參與構(gòu)成血管內(nèi)皮細(xì)胞〔2〕，ACE和AngⅡ與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂密切相關(guān)〔3〕。ACE2是近年來被發(fā)現(xiàn)的RAS系統(tǒng)新成員〔4〕。ACE2、Ang-(1-7)與其受體MAS共同構(gòu)成ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸，ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸能夠拮抗AngⅡ，在RAS系統(tǒng)過度激活所致的動(dòng)脈粥樣硬化病變中起保護(hù)作用。目前少有關(guān)于ACE和ACE2基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與冠心病(CHD)遺傳易感性的研究報(bào)道。本研究探討ACE、ACE2基因多態(tài)性與中國(guó)北方漢族人群CHD遺傳易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1對(duì)象 病例組為2009年1月至2013年12月在吉林大學(xué)第一醫(yī)院經(jīng)冠脈造影確診并住院治療的CHD患者，心電圖變化及臨床表現(xiàn)均符合1979年世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)，共246例。對(duì)照組為同期在該院體檢中心體檢的健康個(gè)體251例。兩組均為中國(guó)北方漢族人且個(gè)體間均無血緣關(guān)系。病例組男130例，女116例，年齡(64.74±11.35)歲，高血壓106例，糖尿病52例；對(duì)照組男124例，女127例，年齡(62.39±12.16)歲，高血壓59例，糖尿病18例。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而患高血壓和糖尿病比率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1.2基因組DNA的提取 經(jīng)研究對(duì)象知情同意后，于清晨抽取外周靜脈血5 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)，-20℃凍存。按照DNA提取試劑盒(天跟，北京)實(shí)驗(yàn)步驟從全血中提取全基因組DNA，-20℃凍存。采用紫外分光光度計(jì)(Bio-Rad，美國(guó))檢測(cè)DNA含量及純度。

1.3引物設(shè)計(jì) 檢索HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)北方漢族人群ACE、ACE2基因SNPs數(shù)據(jù)。采用Haploview4.2軟件篩選出ACE基因rs4461142及ACE2基因rs1514283，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，rs4461142位點(diǎn)上游引物5′-TTCTTTCTTACGGTTCT-3′，下游引物5′-TTGACTGGCTGTGC-3′；rs1514283位點(diǎn)上游引物5′-AAGCCATTTCCCATCC-3′，下游引物5′-TCATCAACAGCTCCAC-3′。

1.4基因型檢測(cè) ①PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為20 μl，含有二餾滅菌水(dd H2O)4 μl，2×Taq PCR MasterMix 10 μl，上下游引物各2 μl，模板DNA 2 μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃，30 s；41℃(rs4461142)/46℃(rs1514283)，30 s；72℃，1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μl，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR結(jié)果。②限制性酶切：酶切體系為20 μl，包含dd H2O 7.2 μl，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，限制性內(nèi)切酶(rs4461142用Sma I，rs1514283用TspR I)0.8 μl，10×Buffer/10×Buffer TangoTM 2 μl。酶切體系于37℃(rs4461142)/60℃(rs1514283)恒溫箱中孵育4～16 h后，2.5%瓊脂糖凝膠電泳。采用凝膠成像系統(tǒng)觀察分析酶切圖譜，判斷基因型。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行分析，擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析基因型頻數(shù)分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，χ2檢驗(yàn)分析SNPs位點(diǎn)的基因型、等位基因頻數(shù)分布與CHD的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié) 果

2.1酶切電泳結(jié)果 ACE基因rs4461142位點(diǎn)TT基因型完全未切開，具有283 bp片段；CC基因型完全切開，具有187 bp片段；CT基因型不完全切開，具有283 bp和187 bp兩個(gè)片段。ACE2基因rs1514283位點(diǎn)AA基因型完全未切開，具有338 bp片段；GG基因型完全切開，具有323 bp片段；CT基因型不完全切開，具有338 bp和323 bp兩個(gè)片段。見圖1。

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 病例組和對(duì)照組rs4461142和rs1514283位點(diǎn)基因型分布均符和Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。見表1。

2.3兩組ACE基因rs4461142和ACE2基因rs1514283位點(diǎn)的基因型和等位基因頻數(shù)分布比較 兩組rs4461142、rs1514283位點(diǎn)基因型頻數(shù)和等位基因頻數(shù)分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.213、0.069；0.977、0.090；均P>0.05)。見表2。

圖1 rs4461142和rs1514283位點(diǎn)電泳圖

組別rs4461142HoHeχ2值P值rs1514283HoHeχ2值P值病例組04820499117403210561049818360206對(duì)照組05660499231201520518049701990721

表2 兩組rs4461142、rs1514283位點(diǎn)基因型和等位基因頻數(shù)分布

3 討 論

CHD是一種威脅人類健康的常見病，其危險(xiǎn)因素包括肥胖癥、高血壓、高血脂、糖尿病、年齡與性別、吸煙、飲酒、環(huán)境因素、遺傳因素等〔5〕。本研究提示高血壓、高血脂、糖尿病對(duì)CHD患者發(fā)病有影響。

動(dòng)脈粥樣硬化是CHD病變的主要病理學(xué)基礎(chǔ)〔6〕。動(dòng)脈硬化是長(zhǎng)期炎癥、血栓和多種細(xì)胞類型(包括平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞)相互作用的復(fù)雜病理過程〔7〕。RAS具有多種雙重調(diào)節(jié)效應(yīng)和體系內(nèi)外的自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)功能，在動(dòng)脈硬化斑塊的形成過程中RAS系統(tǒng)亦起著重要的作用〔8〕。RAS激活后可以通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)、心肌增殖和纖維化、氧化低密度脂蛋白攝取，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制纖溶系統(tǒng)，加速斑塊的不穩(wěn)定性等方面來參與動(dòng)脈粥樣硬化過程中〔9〕。ACE與AngⅡ、AT1受體共同構(gòu)成ACE-AngⅡ-AT1軸。當(dāng)局部RAS系統(tǒng)激活，ACE活性增強(qiáng)，AngⅡ濃度升高，可通過ATI受體促使冠狀動(dòng)脈收縮誘發(fā)冠脈痙攣，并加重動(dòng)脈炎癥，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制纖溶，促進(jìn)凝血，形成血栓〔10〕。ACE2是ACE的同系物，主要作用是將AngⅡ轉(zhuǎn)化為Ang-(1-7)，與MAS受體共同構(gòu)成ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸。ACE2能水解AngⅡ生成Ang-(1-7)，通過MAS受體介導(dǎo)保護(hù)心血管系統(tǒng)，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展過程中，局部的ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸可能與ACE-AngⅡ-ATI軸同時(shí)被激活，前者拮抗后者的促動(dòng)脈粥樣硬化作用〔11〕。ACE基因和ACE2基因遺傳變異可能會(huì)影響其表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)ACE基因是歐洲人群CHD的易感基因〔12〕。本研究結(jié)果提示ACE基因rs4461142位點(diǎn)和ACE2基因rs1514283位點(diǎn)可能與中國(guó)北方漢族人群CHD無關(guān)。由于本研究樣本量較少、檢驗(yàn)效能低，所以尚不能完全排除ACE基因、ACE2基因單核苷酸多態(tài)性在CHD發(fā)生發(fā)展過程中的作用，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并檢測(cè)與CHD發(fā)生可能相關(guān)的其他位點(diǎn)，進(jìn)行基因-基因、基因-環(huán)境之間交互作用分析。

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〔2016-09-15修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

教育部高校博士點(diǎn)專項(xiàng)基金(No.20100061110071)

葉 琳(1960-)，女，教授，博士，主要從事環(huán)境因素與人群健康的關(guān)系及機(jī)制研究。

王樹越(1969-)，女，主要從事心血管疾病預(yù)防保健研究。

R54

A

1005-9202(2017)16-3963-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.024

1 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室

2 江西省腫瘤醫(yī)院