不同階段老年糖尿病患者血管內皮功能差異及大血管保護機制

盧廣民

(臨沂市第三人民醫院，山東 臨沂 276023)

不同階段老年糖尿病患者血管內皮功能差異及大血管保護機制

盧廣民

(臨沂市第三人民醫院，山東 臨沂 276023)

目的比較不同階段老年2型糖尿病(T2DM)患者血管內皮功能差異并探討大血管保護機制。方法選取糖耐量受損患者97例，T2DM患者290例，選取同期在該院體檢的正常糖耐量老年人106例。進一步將T2DM患者分為新診斷的T2DM組(N1組)86例；T2DM達標組(N2組)101例；T2DM未達標組(N3組)103例。超聲測定各組內皮依賴的血管擴張率(FMD)、非內皮依賴的血管擴張率(GTN)、頸動脈內膜中層厚度。硝酸還原酶法、酶聯免疫吸附(ELISA)法測定一氧化氮(NO)、內皮素(ET)-1含量。分離外周血單個核細胞，熒光定量PCR檢測胃蛋白酶原C(PGC)-1α mRNA、白細胞介素(IL)-1 mRNA轉錄水平；Western印跡檢測P-Akt(Ser473)蛋白表達。結果T2DM組FMD值明顯低于正常糖耐量組和糖耐量受損組(P<0.05)；N2組和N3組GTN值和頸動脈內膜中層厚度均明顯低于N1組、正常糖耐量組、糖耐量受損組(P<0.05)。N1組基礎NO、ET-1水平明顯高于其余各組(P<0.05)。T2DM組PGC-1α mRNA、IL-1 mRNA表達量均明顯高于非T2DM組(P<0.05)。T2DM組P-Akt(Ser473)蛋白表達量明顯低于正常糖耐量組與糖耐量受損組(P<0.05)；N1組明顯高于N3組(P<0.05)。PGC-1α mRNA水平是FMD的獨立影響因素；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、舒張壓是GTN的獨立影響因素；收縮壓是頸動脈內膜中層厚度的獨立影響因素。結論FMD可敏感預測早期老年T2DM大血管病變，GTN、頸動脈內膜中層厚度偏重于病變進展；PGC-1α基因可經內皮依賴和非依賴兩種機制保護糖尿病大血管。

2型糖尿病；血管內皮功能；大血管保護

2型糖尿病(T2DM)存在Pi3k-Akt信號通路傳導障礙，而該通路又參與胰島素刺激的血管內皮一氧化氮(NO)分泌的調控〔1〕，因此可推測新確診的T2DM患者可能存在NO水平下降導致的血管內皮功能障礙。目前，關于不同血糖水平下內皮依賴的血管擴張率(FMD)、非內皮依賴的血管擴張率(GTN)、頸動脈內膜中層厚度對早期血管內皮功能障礙的預測價值以及胃蛋白酶原C(PGC)-1α基因對糖尿病(DM)大血管保護機制尚無系統研究報道。本研究旨在探討不同階段老年T2DM患者血管內皮功能差異及PGC-1α基因對大血管的保護作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 經倫理委員會批準并簽署知情同意書后，根據中國糖尿病指南標準收集2015年6月至2016年6月臨沂市第三人民醫院就診的糖耐量受損患者97例，其中男46例，女51例，年齡60～78歲，平均(68.31±5.08)歲；T2DM患者290例，男138例，女152例，年齡60～81歲，平均(69.81±7.35)歲。選取同期在本院體檢的正常糖耐量老年人106例為對照，男48例，女58例，年齡60～76歲，平均(68.12±7.34)歲。按病程和糖化血紅蛋白(HbA1c)水平將T2DM患者分為：病程≤1年新診斷的T2DM組(N1組)86例；病程≥5年且HbA1c<7%的糖尿病達標組(N2組)101例；病程≥5年且HbA1c≥7%的T2DM未達標組(N3組)103例。

1.2方法

1.2.1血管擴張率測定 FMD測定：研究對象清晨空腹且膀胱排空后，超聲獲取右肘肱動脈縱切面，固定探頭。以靜息狀態下肱動脈內徑為基礎對照，充氣使壓力升至250 mmHg，完全阻斷血流5 min后放氣，在1 min時測定肱動脈內徑，計算血管擴張率。GTN測定：研究對象舌下含服500 μg硝酸甘油時加壓和釋壓形成的肱動脈內徑擴張情況，計算血管擴張率。

1.2.2頸動脈內膜中層厚度檢測 研究對象頸動脈內膜中層厚度定義為頸動脈壁內膜和中膜厚度之和。選取左、右兩側頸動脈近端、中端、遠端各1 cm長的血管腔為靶區，超聲測定血液內膜界面與血管壁中膜、外膜界面間的距離，取雙側均值為頸動脈內膜中層厚度。

1.2.3血管內皮功能指標檢測 酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒檢測內皮素(ET)-1水平，試劑盒購于上海廣銳生物科技有限公司；采用硝酸還原酶法測定NO水平，試劑盒購于上海恒遠生物科技有限公司。檢測過程均嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.4外周血單個核細胞分離 取5 ml抗凝處理后的靜脈血用等量磷酸緩沖液稀釋，緩慢加于淋巴細胞分離液表面，室溫下3 000 r/min離心30 min，離心管內液體從上到下分別為血漿磷酸緩沖液、外周血單個核細胞層、淋巴細胞分離液、粒細胞、紅細胞；吸取外周血單個核細胞轉入加含1640細胞培養基的離心管中備用。

1.2.5熒光定量PCR檢測 Trizol試劑提取外周血單個核細胞中總RNA，逆轉錄制備cDNA。使用實時熒光定量PCR儀檢測PGC-1α mRNA、IL-1 mRNA轉錄水平。反應體系40 μl，包括SYBR Green 15 μl、上游和下游引物各1 μl、cDNA 1 μl、蒸餾水23 μl。以GAPDH為內標基因，引物設計由上海滬宇生物科技有限公司完成。常規擴增條件下進行40個循環，讀取Ct值。

1.2.6Western印跡檢測P-Akt(Ser473)蛋白表達 外周血單個核細胞與100 μl蛋白裂解液混勻，水浴反應10 min，5 000 r/min離心15 min，BCA法測定總蛋白含量。取50 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，濕法轉移到PVDF膜，滴加兔抗人P-Akt(Ser473)一抗(1∶100)和β-actin單克隆抗體(1∶500)孵育過夜，滴加HRP標記的二抗，孵育2 h后洗膜，ECL試劑盒顯影，圖像掃描軟件測定膠片上條帶灰度值。

1.3統計學分析 使用SPSS18.0軟件進行t檢驗、Pearson檢驗和Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1各組臨床資料和血管內皮超聲檢測結果 各組收縮壓、舒張壓、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)差異均無統計學意義(P>0.05)。T2DM組FMD值明顯低于正常糖耐量組和糖耐量受損組(P<0.05)；正常糖耐量組和糖耐量受損組之間差異無統計學意義(P>0.05)；T2DM組中FMD值由高到低依次為：N1組>N2組>N3組，組間差異有統計學意義(P<0.05)。N2組和N3組GTN值和頸動脈內膜中層厚度均明顯低于N1組、正常糖耐量組、糖耐量受損組(P<0.05)。見表1。

2.2各組NO、ET-1水平比較 N1組基礎NO、ET-1水平明顯高于N2組、N3組、正常糖耐量組、糖耐量受損組(P<0.05)；正常糖耐量組與糖耐量受損組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組PGC-1α mRNA、IL-1 mRNA表達水平比較 N1、N2、N3組間差異均有統計學意義(P<0.05)；正常糖耐量組與糖耐量受損組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表1 各組臨床資料和血管內皮超聲檢測結果比較(±s)

與正常糖耐量組比較:1)P<0.05；與糖耐量受損組比較:2)P<0.05；與N1組比較:3)P<0.05

表2 各組血管內皮功能指標比較(±s)

與N1組比較：1)P<0.05

表3 各組PGC-1α mRNA、IL-1 mRNA表達水平比較(±s)

2.4各組P-Akt(Ser473)蛋白水平比較 N1組、N2組、N3組P-Akt(Ser473)蛋白表達量分別為(0.76±0.22)、(0.74±0.20)、(0.46±0.11)，明顯低于正常糖耐量組與糖耐量受損組的(0.91±0.14)、(0.89±0.10)，P<0.05；N1組與N2組差異無統計學意義(P>0.05)；N1組明顯高于N3組(P<0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測各組P-Akt(Ser473)蛋白的表達

2.5相關性分析 收縮壓與FMD呈負相關(r=-0.318，P<0.05)；收縮壓、舒張壓、LDL-C與GTN呈負相關(r=-0.206、-0.293、-0.164，P<0.05)；收縮壓、TG與頸動脈內膜中層厚度呈正相關(r=0.327、0.235，P<0.05)。PGC-1α mRNA表達量與FMD、GTN呈正相關(r=0.260、0.227，P<0.05)。多因素Logistic回歸分析顯示，PGC-1α mRNA水平是FMD的獨立影響因素，LDL-C、舒張壓是GTN的獨立影響因素，收縮壓是頸動脈內膜中層厚度的獨立影響因素。

3 討 論

FMD通過檢測血內容積瞬間最大改變從而間接反映出肱動脈內皮細胞瞬間NO釋放量，與血管內皮功能密切相關〔2〕。GTN可直接刺激平滑肌細胞引發血管舒張，其機制與內皮細胞分泌的NO無相關性，與血管平滑肌功能相關〔3〕。相關研究顯示，當危險因素存在時頸總動脈因壓力較大，出現血管壁內膜增厚的風險明顯高于其他部位，可作為大血管動脈硬化早期預測因子〔4〕。本研究結果說明FMD早期預測敏感性較高GTN和頸動脈內膜中層厚度更側重于對動脈硬化進展的預測。

血管平滑肌重構引發的動脈粥樣硬化是DM大血管并發癥的主要病理基礎，多為血管舒張機制受損〔5〕。相關研究顯示，血管內皮細胞分泌的NO、ET-1可誘發血管舒張，內皮功能受損會導致NO、ET-1合成降低，進而促發動脈粥樣硬化。因此，對血管內皮合成的NO、ET-1進行評估可有效預測大血管并發癥〔6〕。本研究結果提示P-Akt(Ser473)信號通路介導的血管內皮NO、ET-1合成在DM早期已出現缺損，同時IL-1介導的NO、ET-1合成在N1組中對NO、ET-1貢獻較大。N2組NO、ET-1水平明顯低于N1組，但IL-1 mRNA水平無明顯變化，考慮因為PGC-1α轉錄水平降低，其原因可能與線粒體功能減弱誘發eNOS合成量降低有關。

PGC-1α基因可促進線粒體合成、脂肪酸氧化，減少細胞中ROS聚集，是調控血管內皮細胞能量代謝和抑制凋亡的主要因子〔7〕。本研究結果說明PGC-1α基因可通過對血管內皮細胞線粒體功能的調控，經內皮依賴和非依賴兩種途徑保護DM大血管。

1邢玲玲.P13K/Akt通路在糖尿病腎病足細胞損傷中的作用〔D〕.石家莊：河北醫科大學,2012.

2de Jager J,Kooy A,Schalkwijk C,etal.Long-term effects of metformin on endothelial function in type 2 diabetes:a randomized controlled trial〔J〕.J Int Med,2014;275(1):59-70.

3Hopkins ND,Cuthbertson DJ,Kemp GJ,etal.Effects of 6 months glucagon-like peptide-1 receptor agonist treatment on endothelial function in type 2 diabetes mellitus patients〔J〕.Diabetes Obes Metab,2013;15(8):770-3.

4魏海峰,錢 軍,鮑丙波,等.微血管形成在腰椎間盤退變過程中的表現特征及影響因素〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2016;17(5):632-5.

5龔 蕾.高糖致胰島微血管內皮細胞凋亡的機制及年齡相關胰島β細胞再生的研究〔D〕.濟南：山東大學,2013.

6Barone Gibbs B,Dobrosielski DA,Bonekamp S,etal.A randomized trial of exercise for blood pressure reduction in type 2 diabetes:effect on flow-mediated dilation and circulating biomarkers of endothelial function〔J〕.Atherosclerosis,2012;224(2):446-53.

7孫慧琳.GLP-1對AGEs誘導的血管內皮細胞損傷的拮抗作用及機制研究〔D〕.廣州：南方醫科大學,2015.

〔2016-12-12修回〕

(編輯 郭 菁)

盧廣民(1967-)，男，副主任醫師，主要從事內分泌-糖尿病方面的臨床研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)16-3986-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.035