DAPPER1對食管鱗狀細胞癌細胞惡性生物學行為的影響及其表觀遺傳學調節機制

郭艷麗，鄺 鋼，周 珍，董稚明，郭 煒，沈素朋，梁 佳，郭 鑫

·論 著·

DAPPER1對食管鱗狀細胞癌細胞惡性生物學行為的影響及其表觀遺傳學調節機制

郭艷麗，鄺 鋼，周 珍，董稚明，郭 煒，沈素朋，梁 佳，郭 鑫

目的 檢測DAPPER1蛋白對食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)細胞株惡性生物學行為的影響，并進一步分析ESCC組織中DAPPER1蛋白表達及引起其表達異常的可能機制。方法 應用MTT、克隆形成、劃痕修復實驗檢測DAPPER1對ESCC細胞株惡性生物學行為的影響；應用RT-PCR及甲基化特異性PCR(methylation specific PCR, MSP)技術檢測細胞株(TE13、T.Tn、Eca109)中DAPPER1 mRNA的表達及其啟動子區甲基化狀態；應用免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)法檢測ESCC組織中DAPPER1蛋白的表達。結果 DAPPER1在3株細胞中呈弱表達或陰性，應用甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-Dc)處理細胞后，其表達強度在各細胞株中均有不同程度的增加；同時，DAPPER1過表達及5-Aza-Dc處理可明顯抑制TE13細胞的增殖及遷移能力；而應用組蛋白去乙酰化酶抑制劑trichostatin A(TSA)處理細胞株后，DAPPER1在各細胞株中的表達無明顯改變；DAPPER1蛋白在ESCC組織中的表達較癌旁組織明顯下調(P<0.01)，且其表達與該基因啟動子區域異常甲基化狀態有關(P<0.01)。結論 ESCC中DAPPER1主要起抑癌基因作用，并且該基因啟動子區域的異常高甲基化可能是引起其表達下調的主要機制之一。

食管腫瘤；甲基化；增殖；遷移；DAPPER1

Wnt/β-catenin信號轉導通路參與細胞的增殖、分化等多種生命過程，研究表明該通路的異常活化與多種腫瘤的發生、發展相關，包括食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)[1]。因此，有關該通路關鍵因子功能的研究對于明確ESCC的發病機制具有重要意義。研究指出DAPPER1在多種腫瘤中的表達水平低于正常對照組織并具有抑制腫瘤細胞生長和轉移的能力，被認為是Wnt通路的抑制因子之一[2]。但其在ESCC中的作用及其表達情況仍未見相關報道。本實驗通過分析DAPPER1蛋白對ESCC細胞株惡性生物學行為的影響及ESCC組織中DAPPER1的表達及其甲基化狀態，探討DAPPER1在ESCC中的可能作用及引起其表達調控異常的可能機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2005年～2009年河北醫科大學第四醫院胸外科診治的ESCC患者159例。其中男性93例，女性66例，平均年齡57.9歲(36～79歲)。患者術前均未行放、化療。每例患者均取癌組織原發灶及距癌組織2～5 cm處的癌旁組織，手術切除標本一部分保存在-80 ℃低溫冰箱用于提取DNA及RNA，另一部分進行石蠟包埋，常規HE染色，經病理醫師診斷證實癌組織均為ESCC，癌旁組織均為正常黏膜組織或增生的黏膜組織。腫瘤患者臨床分期根據美國癌癥聯合會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)及國際抗癌聯盟(Union for International Cancer Control, UICC)標準；腫瘤病理分級根據WHO標準；上消化道腫瘤(upper gastrointestinal cancers, UGIC)家族史陽性定義為家族中有一名以上一級親屬和(或)兩名以上二級親屬患食管癌/賁門癌/胃癌者。本實驗經醫院倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 實驗用的5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-Dc)、曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)、噻唑藍(MTT)均購自美國Sigma公司；FuGENE HD轉染試劑盒購自瑞士Roche公司；亞硫酸氫鹽轉化試劑盒(Epitect Fast Bisulfite Conversion Kits)購自德國Qiagen公司；甲基轉移酶(M.SssI)購自北京美科美生物公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒(Reverse Transcription System A3500)購自Promega北京生物公司；本實驗所用全部引物均由北京賽百勝基因公司合成。兔抗人多克隆抗體DAPPER1(1 μg/mL，ab72078)購自英國Abcam公司；ECL發光試劑購自碧云天公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及藥物處理 常規培養TE13、T.Tn、Eca109細胞株，待細胞密度較低且處于對數生長期時，分別用5 μmol/L的5-Aza-Dc處理72 h或0.3 μmol/L TSA處理24 h，期間每24 h更換1次培養液，處理完畢后更換為完全培養基繼續培養，24 h后收集細胞，提取DNA及RNA，進行后續檢測。藥物劑量及處理時間依據先前文獻報道[3-5]。未經藥物處理的細胞作為對照組。

1.3.2 建立DAPPER1過表達的穩轉細胞株 將含人全長DAPPER1基因的pcDNA3.1質粒和空載體質粒分別轉染至低表達DAPPER1的人ESCC細胞株TE13中，經G418抗性篩選，得到過表達DAPPER1的穩轉細胞株DAPPER1/TE13及對照組細胞株pcDNA3.1/TE13。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖能力 將對數生長期的DAPPER1/TE13及pcDNA3.1/TE13細胞以及5-Aza-Dc處理72 h后TE13細胞分別消化并接種于96孔板，測定各孔吸光度值，檢測細胞的增殖能力。

1.3.4 平板克隆形成實驗檢測細胞貼壁克隆生長的能力 選取生長狀態良好的對數生長期TE13細胞、DAPPER1/TE13及5-Aza-Dc處理72 h后TE13細胞，將細胞消化吹打為單細胞混懸液，接種于35 mm培養皿(500個細胞/皿)。完全培養基培養，待有克隆長出，蘇木精染色，鏡下觀察，并計算各組細胞的克隆形成率。

1.3.5 劃痕修復實驗檢測細胞的遷移能力 將對數生長期的兩組TE13細胞及一組過表達DAPPER1的DAPPER1/TE13細胞分別消化并接種于24孔板，其中一組TE13細胞株用5-Aza-Dc處理72 h，分別用10 μL移液器吸頭垂直于孔底劃一條直線，鏡下觀察不同時間點劃痕愈合情況。初始劃痕寬度定義為1。

1.3.6 甲基化特異性PCR(methylation specific PCR, MSP)技術檢測DAPPER1基因的甲基化狀態 采用酚/氯仿抽提法，提取細胞株及組織標本中的DNA，分光光度計進行定量后，取適量DNA按照亞硫酸氫鹽轉化試劑盒說明書將DNA變性及純化。MSP引物序列：上游 5′-CGGGATAGTAGTAGTCGGC-3′，下游 5′-AAACGCTAAAACTACGACCGCG-3′，產物長度121 bp。用經甲基化酶(Sss I)處理后的基因組DNA作為甲基化的陽性對照，用無消化系統腫瘤及其它系統腫瘤的正常人外周血DNA作為非甲基化的陽性對照，陰性對照則用滅菌雙蒸水取代DNA模板進行PCR。另隨機選取10%標本進行重復實驗以驗證結果的可靠性。

1.3.7 RT-PCR技術檢測DAPPER1基因mRNA的表達 按Trizol試劑說明書提取細胞株中總RNA，并參照逆轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄成cDNA。用于檢測DAPPER1基因mRNA的表達。引物序列：上游5′-CACAAGCGAACTGACTACCG-3′，下游5′-GTAATTGCTCTGCTCGTCCT-3′，片段大小237 bp。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，GAPDH作為內參照。利用圖像分析系統Gel work-2ID對mRNA進行定量。

1.3.8 免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)法檢測DAPPER1蛋白的表達 應用常規SP法。石蠟切片常規脫蠟，梯度乙醇水化。3%甲醇過氧化氫封閉后用EDTA高壓修復2 min，血清封閉，一抗孵育過夜，再依次加入二抗和三抗，DAB顯色，蘇木精復染。以PBS代替一抗做空白對照。陽性染色定位于細胞質。以傳統的染色強度與著色面積雙評分的方法對結果進行判定[6]。每張切片隨機選擇5個不重復的高倍視野(×400)，根據染色深淺和著色細胞所占百分比進行評分。(1)按細胞染色強度評分：無陽性染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按著色百分比評分：陽性細胞數<25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，≥75%為3分。將兩項得分結果相加：0～2分為陰性，3～6分為陽性。

2 結果

2.1 ESCC細胞株中啟動子區甲基化及組蛋白乙酰化對DAPPER1基因表達的影響 為明確表觀遺傳學的兩大機制(甲基化及組蛋白乙酰化)是否對DAPPER1基因的表達有影響，此次實驗分別應用5-Aza-Dc及TSA處理細胞株。結果顯示，DAPPER1基因在3株細胞株中均呈弱陽性或陰性，應用5-Aza-Dc處理后，其mRNA表達增強或恢復為陽性；而應用TSA處理細胞后，DAPPER1基因在3株細胞株中的表達無明顯變化。同時，MSP結果顯示，5-Aza-Dc處理前，3株細胞株均可檢測出較強的甲基化條帶，處理后，甲基化條帶減弱或消失，而非甲基化條帶出現或增強(圖1)。

圖1 5-Aza-Dc及TSA處理對DAPPER1 mRNA表達及 基因甲基化狀態的影響

M.甲基化基因；U.非甲基化基因；GAPDH為內參基因

2.2 DAPPER1基因對ESCC細胞惡性生物學行為的影響

2.2.1 DAPPER1過表達及5-Aza-Dc處理對TE13細胞增殖能力的影響 利用MTT實驗檢測DAPPER1基因過表達及5-Aza-Dc處理對TE13細胞增殖能力的影響。結果顯示，TE13、pcDNA3.1/TE13、DAPPER1/TE13及5-Aza-Dc處理細胞株其增殖指數分別為0.894±0.016、0.886±0.019、0.394±0.029、0.480±0.028，與未經處理的TE13細胞株及轉入空載體的pcDNA3.1/TE13相比，DAPPER1基因過表達細胞株及5-Aza-Dc處理可使細胞的增殖指數明顯下降(P<0.01，圖2)。

圖2 MTT法檢測DAPPER1基因對TE13細胞增殖能力的影響**P<0.01，##P<0.01

2.2.2 DAPPER1過表達及5-Aza-Dc處理對TE13細胞貼壁克隆生長的變化 應用平板克隆形成實驗檢測DAPPER1過表達及5-Aza-Dc處理對TE13細胞貼壁克隆生長的變化。結果顯示：過表達DAPPER1及5-Aza-Dc處理后的TE13細胞均較野生型TE13細胞克隆形成能力減弱[(29.600±6.974)%vs(61.867±10.086)%；(15.867±3.443)%vs(61.867±10.086)%]，且差異有統計學意義(t過表達=16.288，P=0.004；t處理=11.218，P=0.008；圖3)。

圖3 平板克隆形成實驗檢測DAPPER1對TE13細胞 貼壁生長能力的影響 **P<0.01

2.2.3 DAPPER1過表達及5-Aza-Dc處理對TE13細胞遷移能力的影響 應用劃痕修復實驗檢測DAPPER1基因過表達及5-Aza-Dc處理對TE13細胞遷移能力的影響。過表達DAPPER1的DAPPER1/TE13及5-Aza-Dc處理后的TE13細胞在12 h、24 h、36 h、48 h各時間點的劃痕相對寬度值見表1，DAPPER1過表達以及5-Aza-Dc處理使TE13細胞在各時間點的遷移率均低于未經處理的TE13，且差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 過表達DAPPER1及5-Aza-Dc處理后的TE13 細胞在不同時間點的相對劃痕寬度±s，n=3)

#P<0.05；*P<0.05

2.3 ESCC組織中DAPPER1蛋白表達及其與臨床病理特征的關系 ESCC組織中DAPPER1蛋白陽性率為59.1%(94/159)，明顯低于對應的癌旁非腫瘤組織(79.2%，126/159)，且差異有統計學意義(χ2=15.104，P<0.001)。DAPPER1蛋白陽性率在有淋巴結轉移組、臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期患者中明顯高于無淋巴結轉移組及臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05)，而該蛋白表達與ESCC患者年齡、性別、腫瘤組織的病理分級及上消化道腫瘤家族史均無關(P>0.05，表2)。

表2 食管鱗狀細胞癌中DAPPER1蛋白表達與 臨床病理特征的關系

2.4 ESCC組織中DAPPER1蛋白表達與該基因啟動子區甲基化狀態的關系 在94例DAPPER1蛋白陽性的ESCC組織中，基因啟動子區存在高甲基化現象者23例，甲基化頻率(24.5%)明顯低于DAPPER1蛋白陰性的ESCC組織；ESCC組織中DAPPER1蛋白表達與其甲基化狀態有關(表3)。

表3 食管鱗狀細胞癌中DAPPER1蛋白表達與其 基因甲基化狀態的關系

M.甲基化；U.非甲基化

3 討論

DAPPER家族是在以爪蟾為模型研究神經管的分化時，運用酵母雙雜交篩選發現的可與Dishevelled相互作用的抑制因子[7]。DAPPER1是該家族的成員之一，研究發現DAPPER1與多條信號轉導通路，尤其是Wnt通路的關系極為密切，并可通過對信號分子的調控參與腫瘤的發生、發展[8-10]。

DAPPER1基因定位于人類染色體14q23.1區域，在多種惡性腫瘤中均報道有該區域的缺失或斷裂，因此認為在染色體的該區域可能存在腫瘤抑制基因[11]。研究發現，在肝細胞癌[12]、胃癌[8]、肺癌[13]等多種惡性腫瘤中DAPPER1的表達低于正常組織，提示其抑癌基因的作用，并且在對肺癌[13]的研究中發現DAPPER1低表達者預后較差。同時研究指出DNA啟動子甲基化可能是導致DAPPER1表達下調的表觀遺傳學機制之一[14]。但有關DAPPER1在ESCC中的表達及其發揮的生物學功能仍未見報道。本組實驗發現，ESCC組織中DAPPER1蛋白表達明顯低于對應癌旁非腫瘤組織，與先前的研究報道一致。提示DAPPER1蛋白在ESCC中可能發揮抑癌基因作用。

為進一步明確DAPPER1在ESCC中發揮的作用及引起其表達異常的可能機制。研究者首先檢測了3株ESCC細胞株中DAPPER1基因mRNA的表達，發現均為陰性或弱表達。應用5-Aza-Dc進行處理，該藥物可通過降低DNA甲基化酶的活性而重新開啟因高甲基化而沉默的基因。結果顯示處理后3株ESCC細胞系DAPPER1表達均明顯升高；同時MSP結果顯示，5-Aza-Dc處理后該基因的甲基化條帶減弱或消失，而非甲基化條帶則明顯增強；兩結果共同提示ESCC中DAPPER1基因的高甲基化水平可能是引起其表達下調的機制之一。對ESCC組織標本的檢測發現，癌組織中DAPPER1基因的高甲基化現象明顯高于癌旁非腫瘤組織，且與DAPPER1蛋白表達缺失相關，進一步提示在ESCC組織標本中DAPPER1基因存在甲基化失活現象。組蛋白乙酞化是表觀遺傳修飾的另一主要方面。組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA可通過抑制組蛋白的去乙酰化而調節基因的表達。本實驗應用TSA處理細胞，發現DAPPER1表達在處理前后無明顯改變，初步判定組蛋白的乙酰化對該基因的表達無明顯影響。同時，本組實驗應用MTT、克隆形成以及劃痕修復實驗分別檢測了DAPPER1對TE13惡性生物學行為的影響。結果顯示，5-Aza-Dc處理及DAPPER1過表達可明顯抑制TE13細胞的增殖及遷移能力。Yin等[9]在對乳腺癌的研究中也同樣發現該基因在體內及體外可通過誘導細胞凋亡而抑制細胞的增殖，并可通過拮抗Wnt/β-catenin信號轉導通路而抑制細胞的遷移，與本實驗結果相符。在對肺癌[13]的研究中也同樣發現抑制DAPPER1表達可以激活Wnt/β-catenin信號通路增強肺癌細胞的增殖和侵襲能力。

綜上所述，DAPPER1可抑制ESCC細胞的增殖及遷移能力，并在ESCC組織標本中的表達量明顯低于癌旁非腫瘤組織，提示了其在ESCC中的抑癌基因作用；并且基因啟動子區的高甲基化可能是引起其表達下調的主要表觀遺傳學機制之一。

[1] 郭艷麗, 王馥麗, 郭 煒, 等. 賁門腺癌中SFRP1、DKK3基因啟動子區甲基化狀態的聯合分析[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2010,26(2):154-157.

[2] Katoh M. Identification and characterization of human DAPPER1 and DAPPER2 genes in silico[J]. Int J Oncol, 2003,22(4):907-913.

[3] Meng C F, Zhu X J, Peng G,etal. Re-expression of methylation-induced tumor suppressor gene silencing is associated with the state of histone modification in gastric cancer cell lines[J]. World J Gastroenterol, 2007,13(46):6166-6171.

[4] Kondo Y, Shen L, Issa J P. Critical role of histone methylation in tumor suppressor gene silencing in colorectal cancer[J]. Mol Cell Biol, 2003,23(1):206-215.

[5] Guo W, Cui L, Wang C,etal. Decreased expression of RASSF1A and upregulation of RASSF1C is associated with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Clin Exp Metastasis, 2014,31(5):521-533.

[6] Umemoto M, Yokoyama Y, Sato S,etal. Carbonyl reductase as a significant predictor of survival and lymph node metastasis in epithelial ovarian cancer[J]. Br J Cancer, 2001,85(7):1032-1036.

[7] Kivim?e S, Yang X Y, Cheyette B N. All Dact (Dapper/Frodo) scaffold proteins dimerize and exhibit conserved interactions with Vangl, Dvl, and serine/threonine kinases[J]. BMC Biochem, 2011,30:12-33.

[8] Wang S, Kang W, Go M Y,etal. Dapper homolog 1 is a novel tumor suppressor in gastric cancer through inhibiting the nuclear factor-κB signaling pathway[J]. Mol Med, 2012,18(20):1402-1411.

[9] Yin X, Xiang T, Li L,etal. DACT1, an antagonist to Wnt/β-catenin signaling, suppresses tumor cell growth and is frequently silenced in breast cancer[J]. Breast Cancer Res, 2013,15(2):R23.

[10] Hou J, Wen Y H, Feng K N,etal. DACT1 is involved in human placenta development by promoting Wnt signaling[J]. Arch Gynecol Obstet, 2015,291(6):1289-1296.

[11] Astolfi A, Nannini M, Pantaleo M A,etal. A molecular portrait of gastrointestinal stromal tumors: an integrative analysis of gene expression profiling and high-resolution genomic copy number[J]. Lab Invest, 2010,90(9):1285-1294.

[12] Yau T O, Chan C Y, Chan K L,etal. HDPR1, a novel inhibitor of the WNT/β-catenin signaling, is frequently downregulated in hepatocellular carcinoma: involvement of methylation-mediated gene silencing[J]. Oncogene, 2005,24(9):1607-1614.

[13] Yang Z Q, Zhao Y, Liu Y,etal. Downregulation of hdpr1 is associated with poor prognosis and affects expression levels of p120-catenin and beta-catenin in nonsmall cell lung cancer[J]. Mol Carcinog, 2010,49(5):508-519.

[14] Deng J, Liang H, Zhang R,etal. Methylated CpG site count of dapper homolog 1 (DACT1) promoter prediction the poor survival of gastric cancer[J]. Am J Cancer Res, 2014,4(5):518-527.

Effect of DAPPER1 on malignant biological behavior ofesophageal carcinoma cells and its epigenetic regulatory mechanism

GUO Yan-li, KUANG Gang, ZHOU Zhen, DONG Zhi-ming , GUO Wei, SHEN Su-peng, LIANG Jia, GUO Xin

(DepartmentofPathology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,HebeiCancerInstitute,Shijiazhuang050011,China)

Purpose To investigate the effect of DAPPER1 on the malignant biological behavior in esophageal carcinoma cells, and further to analyze the expression and the possible regulated mechanism of DAPPER1 in esophageal squamous cell cancer (ESCC) samples. Methods MTT assay, colony formation assay and wound healing were used to examine the effect of DAPPER1 on malignant biological behavior in esophageal carcinoma cells, RT-PCR and MSP methods were applied respectively to examine the expression and the methylation status of DAPPER1 in three ESCC cell lines (TE13, T.Tn, Eca109). Immunohistochemistry was used to examine the DAPPER1 protein expression. Results The negative or weak expression of DAPPER1 was detected in ESCC cell lines. After treated with 5-Aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-dC, a demethylation agent), the expression level of DAPPER1 was obviously increased. Meanwhile, over expression of DAPPER1 or treated with 5-Aza-Dc could obviously inhibit proliferation and immigration abilities of TE13 cell line. The level of DAPPER1 expression had no obviously change after treated with trichostatin A (TSA). Decreased protein expression of DAPPER1 was observed in ESCC tumor tissues compared with non-cancerous tissues (P<0.01), and associated with the methylation status of this gene (P<0.01). Conclusion DAPPER1 plays an important role of tumor suppressor gene in esophageal carcinoma, and the aberrant hypermethylation may be one of the main mechanisms in abnormal expression of this gene.

esophageal neoplasms; methylation; proliferation; immigration; DAPPER1

國家自然科學基金(81472335)、河北省醫學科學研究重點課題計劃項目(20170698)

河北醫科大學第四醫院河北省腫瘤研究所病理研究室，石家莊 050011

郭艷麗，女，博士，副主任醫師。E-mail: yanli800224@163.com 郭 煒，女，博士，主任醫師，通訊作者。E-mail: guowei7303@163.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.001.html

R 735.1

A

1001-7399(2017)08-0827-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.001

接受日期：2017-05-16