叉頭框M1在結直腸癌中的表達及臨床意義

陸 明，胡孔旺，王宜文，李 昊，曹立宇

叉頭框M1在結直腸癌中的表達及臨床意義

陸 明1，胡孔旺1，王宜文1，李 昊2，曹立宇2

目的 探討叉頭框M1(FOXM1)在結直腸癌中的表達及與臨床病理特征、預后的關系。方法 采用免疫組化SP法檢測297例結直腸癌組織和80例對應癌旁正常組織中FOXM1的表達；Western blot法檢測20例新鮮結直腸癌組織及對應癌旁組織中FOXM1的表達。結果 FOXM1在結直腸癌組織中的陽性率(70.97%)顯著高于癌旁組織(17.50%，P<0.01)；FOXM1表達與結直腸癌浸潤深度、淋巴結轉移、脈管內癌栓轉移、遠處轉移和TNM分期有關(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤部位、大小、分化程度、CEA、CA199等無關(P>0.05)。結直腸癌組織中FOXM1蛋白相對表達量(0.855±0.063)明顯高于相應癌旁組織(0.150±0.041，P<0.01)。FOXM1陽性患者的3年生存率明顯低于陰性患者(P<0.01)，且FOXM1為結直腸癌預后的獨立性危險因素。結論 FOXM1蛋白在結直腸癌組織中過表達，且與患者臨床病理特征、預后等因素有關，可能在結直腸癌的發生、轉移等過程中起重要作用，有望成為結直腸癌新的腫瘤標志物和潛在的治療靶點。

結直腸腫瘤；叉頭框M1；免疫組織化學；Western blot法；預后

結直腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，現階段我國結直腸癌的發病率和病死率均僅次于肺癌、胃癌、肝癌、食管癌，位居惡性腫瘤的第5位，且逐年呈上升和年輕化趨勢[1]。目前結直腸癌的治療仍以手術為主，術后輔予放、化療，但其療效一般，國內患者確診后5年生存率仍低于50%，尤其對于有遠處轉移的患者缺乏有效的治療措施，其5年生存率不足10%；即使是病理同一級別的患者，予以同種手術及輔助放、化療等治療方案，患者預后也不同[2]。因此，尋找準確的結直腸癌特異性標志物進行精準靶向治療具有重要意義。FOXM1是FOX家族的重要成員之一，由一長約110個氨基酸的進化上高度保守的DNA結合域構成，稱為“叉頭框結構”或“翼狀螺旋結構”，與腫瘤發生、發展密切相關，特異性表達于增殖期細胞中，是一個典型的與細胞增殖相關的轉錄因子，在細胞增殖、周期調節、細胞分化、DNA損傷修復、血管生成和細胞凋亡等過程中起重要作用[3-4]。FOX家族另一成員FOXO1也被證實在結直腸癌發生、發展過程中發揮重要作用[5]。本文采用免疫組化和Western blot法檢測結直腸癌組織和癌旁正常組織中FOXM1的表達，并隨訪患者的術后3年生存率，分析FOXM1表達與臨床病理參數和預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年1月～2013年12月安徽醫科大學第一附屬醫院行手術治療且資料完整的結直腸癌患者297例(表1)，術前患者均未行放、化療，且無其他合并癥；所選樣本年齡24～88歲，中位年齡61歲，男性176例，女性121例。按AJCC(2010)分期標準：Ⅰ期44例，Ⅱ期124例，Ⅲ期98例，Ⅳ期31例。另選取其中80例遠離癌組織中心5 cm以上的結直腸癌旁組織作為對照。術后所有組織標本均經10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。隨訪自手術后開始，截止時間為2016年12月。另收集2016年11～12月間行手術治療且術前也未行放化療、無其他合并癥的結直腸癌患者的術后新鮮癌組織20例及相對應的癌旁正常組織行Western blot檢測。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 運用免疫組化SP法檢測結直腸癌組織和癌旁正常組織中FOXM1的表達，主要操作步驟如下：用二甲苯和乙醇將組織石蠟切片脫蠟至水化；PBS清洗完全后加入EDTA稀釋液置入微波爐中進行抗原修復；后滴加適量內源性過氧化物酶封閉液封閉10 min；滴加一抗稀釋液(抗體濃度1 ∶150，購自Abcam公司)40～50 μL，4 ℃過夜；第2天，37 ℃復溫30 min后滴加適量二抗工作液(PV6000試劑盒，購自北京中杉金橋公司)，置37 ℃孵育18 min；清洗完畢后滴加DAB顯色工作液顯色，鏡下控制顯色時間，染色完畢后迅速加入蒸餾水終止染色；蘇木精輕度復染，中性樹脂封固；由兩位副高以上病理科醫師雙盲閱片，獨立評分。

1.2.2 Western blot 各取適量組織加裂解液和PMSF勻質裂解后反復離心取上清液提取蛋白；用BCA法行蛋白濃度檢測；后放入100 ℃水浴鍋中煮5 min使蛋白變性；配制10%SDA-PAG凝膠，每孔中加適量蛋白和Loading Buffer混合液，垂直電泳分離；電泳分離完全后將含FOXM1和內參GAPDH的膠段切下轉移到PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉60 min；加入20 mL FOXM1一抗稀釋液(抗體濃度1 ∶300，購自Abcam公司)和20 mL GAPDH一抗稀釋液(抗體濃度1 ∶3 000，購自北京中杉金橋公司)4 ℃過夜，次日洗膜完全后，加入二抗稀釋液(抗體濃度1 ∶3 000，購自博奧森公司)室溫孵育1 h；膜洗完全后，用ECL發光液進行顯影。

1.3 結果判定 免疫組化結果根據切片中陽性腫瘤細胞數占所有腫瘤細胞的百分比和陽性腫瘤細胞的著色強度來判斷評分。(1)按陽性細胞數評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數﹤25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分；(2)按著色強度評分：腫瘤細胞無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結果相乘：0～3分為(-)，4～5分為(+)，6～7分為()，≥8分為()；(0～+)為陰性，(～)為陽性。Western blot結果用Image J行灰度分析，以目的蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值的比值記為其相對表達量，以±s表示。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；計量資料采用t檢驗；生存分析和生存曲線使用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗分析；患者預后多因素相關分析采用Cox比例風險回歸模型。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXM1在結直腸癌組織中的表達 FOXM1在結直腸組織中主要表達于細胞核和細胞質(圖1)，在結直腸癌組織中的陽性率(70.97%，198/279)高于癌旁正常組織(17.50%，14/80)，差異有統計學意義(χ2=61.903，P<0.001)。隨著腫瘤浸潤越深、淋巴結轉移數目越多、伴隨脈管內癌栓轉移和遠處轉移、TNM分期越晚，FOXM1陽性率也相應越高(P<0.05)；但與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、CEA、CA199等因素無關(P>0.05，表1)。

表1 FOXM1表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

*包括低分化、黏液腺癌、印戒細胞癌

2.2 Western blot法檢測結直腸癌及癌旁組織中FOXM1蛋白的表達 20例結直腸癌組織中FOXM1蛋白的平均相對表達量為0.855±0.063，癌旁正常組織的平均相對表達量為0.150±0.041，結直腸癌組織中的相對表達量明顯高于癌旁組織，兩者差異有統計學意義(t=13.886，P=0.005，圖2)。

ABCD

圖1 FOXM1在結直腸癌中的表達：A.0；B.+；C.；D.，SP法

圖2 FOXM1蛋白在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達

2.3 FOXM1表達與結直腸癌3年生存率的關系 所有患者的3年總體生存率為74.41%。FOXM1陽性者的3年生存率為65.15%；FOXM1陰性者的3年生存率為92.92%；FOXM1陽性者的生存率明顯低于陰性者(χ2=25.636，P<0.01)。Cox回歸分析發現，腫瘤分化程度、遠處轉移、TNM分期、CEA、CA199、FOXM1陽性等為影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05，表2，圖3)。

圖3 FOXM1蛋白表達與結直腸癌患者3年總生存率的關系

3 討論

結直腸癌的發生、發展是多基因參與的病理轉變過程，包括原癌基因(如K-RAS、c-myc、EGFR等)的激活和抑癌基因(如APC、DCC、p53等)的失活等[6]。因此從基因水平探索結直腸癌的生物學特性，尋找腫瘤診斷標志物和治療靶點對結直腸癌的預防與治療具有重大的臨床意義。FOXM1是一種原癌基因，其功能大多是通過轉錄激活下游分子的表達來影響細胞周期實現的，在靜止期或未分化細胞中表達較低，當細胞被激活重新進入細胞周期時表達增加[3]。研究表明FOXM1參與腫瘤發生的多種信號途徑如在G1/S期過程中誘導p21及p27等周期調節蛋白的降解，促進細胞進行不斷的循環周期，使RAS-MEK-MAPK信號通路處于持續激活狀態，從而明顯加強了癌細胞增殖能力[7]；另外FOXM1也可通過激活PI3K/Akt、EGFR、NF-κB、Notch等信號通路的作用促進腫瘤的生成[8-11]。

FOXM1是人類惡性腫瘤中表達上調最頻繁的基因之一，與腫瘤的發生、發展密切相關，在子宮頸癌、胃癌、食管癌、肝細胞癌等多種惡性腫瘤組織中均存在高表達[12-15]，且與腫瘤分期和惡性侵襲性密切相關。同樣FOXM1可通過加速結直腸癌細胞周期的進程，促進結直腸癌的發生、發展。如Li等[16]發現，FOXM1表達與腫瘤浸潤深度、區域淋巴結轉移、TNM分期、預后和轉移密切相關，且FOXM1陽性患者更易引起血管、神經的侵犯。Uddin等[17]發現，FOXM1在結直腸癌中的陽性率為66%，且與患者病理分化程度和反應腫瘤增殖性標志物如Ki-67和MMP-9密切相關，但與患者TNM分期及預后無明顯相關性。唐慧等[18]通過對結直腸癌癌組織、結直腸腺瘤組織和正常結直腸組織進行免疫組化分析

表2 結直腸癌患者總生存率的預后影響因素單因素和多因素分析

發現：FOXM1在正常結直腸黏膜、結直腸腺瘤組織、結直腸癌組織中的陽性率分別為66.67%、94.00%、81.58%，三組相比差異有統計學意義(P<0.05)；且推測FOXM1在結直腸腺瘤組織中異常高表達提示FOXM1基因可能參與結直腸腺瘤癌變過程，其過表達在結直腸腺瘤階段就已開始。

本組297例結直腸癌行免疫組化檢測，發現在結直腸癌中，腫瘤浸潤深、有淋巴結轉移、有脈管轉移等情況下，即腫瘤惡性程度越高FOXM1的陽性率亦越高，表明FOXM1可能具有促進結直腸癌的發生、發展、轉移等作用。另有文獻報道，FOXM1能夠調控MMP-2和MMP-9的表達，而MMP-2和MMP-9在降解細胞外基質及基膜中發揮重要作用，與腫瘤的侵襲性和轉移性密切相關[19]；另外FOXM1能與VEGF的啟動子結合從而轉錄調控VEGF的表達，參與腫瘤血管的生成，且VEGF在腫瘤的淋巴結和血行轉移過程中起重要作用[20]；Park等[21]通過建立轉基因小鼠模型，發現FOXM1參與腫瘤的上皮-間質轉換、腫瘤細胞轉移、侵襲及轉移前靶器官微環境的形成等。本組通過對結直腸癌患者的3年隨訪并對結果行生存分析得出FOXM1陽性者的預后明顯差于陰性者(P<0.01)，Cox多因素生存回歸分析得出FOXM1表達為結直腸癌預后的獨立危險因(P=0.005)，可能由于原癌基因FOXM1的陽性率越高，通過調節MMP-2、MMP-9和VEGF等因子的表達從而促進腫瘤侵襲轉移等過程，進而使結直腸癌的惡性程度越高，從而影響此類患者的預后生存時間。在其他多種惡性腫瘤中FOXM1陽性者預后也同樣差于陰性者[22]，因此對FOXM1進行術前檢測對在結直腸的診斷治療等過程具有重要的意義。

綜上所述，FOXM1過表達與結直腸癌的臨床病理特征及預后密切相關，在腫瘤發生、發展等過程中起重要作用，由此FOXM1可作為結直腸癌診斷和治療上的一種新分子標志物，有望成為結直腸癌患者治療上新的靶向位點。

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Expression of FOXM1 in colorectal carcinoma and its clinical significance

LU Ming1, HU Kong-wang1, WANG Yi-wen1, LI Hao2, CAO Li-yu2

(1DepartmentofGastrointestinalSurgery,2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

Purpose To investigate the expression of forkhead box M1 (FOXM1) in human colorectal cancer(CRC) tissues, and to analyze the correlation between its expression and clinicopathological parameters and prognosis of CRC. MethodsThe expression of FOXM1 was examined in 297 cases of CRC tissues and 80 cases of normal peritumoral tissues by immunohistochemistry of SP. Western blot was used to detect the expression of FOXM1 in 20 cases of fresh CRC tissues and the corresponding normal peritumoral tissues. Results The expression of FOXM1 was significantly higher in CRC tissues (60.6%) compared with normal peritumoral tissues ( 17.50%,P<0.01). The positive expression of FOXM1 was related to the depth of invasion, lymph node metastasis, intravascular cancer embolus, distant metastasis and TNM stage (P<0.05). However, there was no correlation with age, sex, tumor location, tumor size, tumor differentiation degree, CEA and CA199 (P>0.05). The relative expression levels of FOXM1 protein was also significantly higher in CRC tissues (0.855±0.063) compared with corresponding normal peritumoral tissues (0.150±0.041,P<0.01). The 3-year overall survival of CRC patients with FOXM1 expression was significantly lower than that of patients without FOXM1 expression (P<0.01), and FOXM1 is an independent prognostic factor for CRC. Conclusion The overexpression of FOXM1 protein in CRC tissues correlate with the clinicopathological characteristics and prognosis. FOXM1 may play an important role in the occurrence and metastasis of CRC, and it may be a new tumor marker and potential therapeutic target for CRC.

colorectal neoplasms; FOXM1; immunohistochemistry; Western blot; prognosis

安徽省省級質量工程項目(2016jxtd061)、安徽醫科大學第一附屬醫院2015度新技術項目(2-22)、安徽醫科大學第一附屬醫院2014后備人才項(20148)

安徽醫科大學第一附屬醫院1胃腸外科、2病理科，合肥 230022

陸 明，男，碩士研究生。E-mail: pwluming@126.com 胡孔旺，男，博士，主任醫師，副教授，碩士生導師，通訊作者。E-mail: hukw@sina.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.005.html

R 735.2

A

1001-7399(2017)08-0847-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.005

接受日期：2017-06-27