葡萄籽原花青素對糖尿病db/db小鼠腎組織細胞表型轉化的影響

韋金英，史永紅，任韞卓，杜云霞，杜春陽，段惠軍，吳海江

葡萄籽原花青素對糖尿病db/db小鼠腎組織細胞表型轉化的影響

韋金英，史永紅，任韞卓，杜云霞，杜春陽，段惠軍，吳海江

目的 觀察葡萄籽原花青素對Ⅱ型糖尿病模型db/db小鼠腎臟細胞中表型轉化標志蛋白α-SMA、E-cadherin表達的影響，旨在揭示葡萄籽原花青素對db/db小鼠糖尿病腎損傷的保護機制。方法 采用Ⅱ型糖尿病模型db/db小鼠為研究對象，16只雄性db/db小鼠隨機分為2組：糖尿病組、糖尿病+葡萄籽原花青素灌胃組，每組各8只；8只相同周齡雄性db/m小鼠作為正常對照組及8只db/m小鼠+葡萄籽原花青素灌胃治療對照組。以葡萄籽原花青素(5 mg/kg)灌胃，持續12周后檢測E-cadherinh、α-SMA、p38MAPK和ERK1/2的蛋白表達。結果 糖尿病組小鼠腎組織中α-SMA、p38MAPK和ERK1/2蛋白表達明顯增加，E-cadherin表達減少，尿中8-OHdG水平增加。葡萄籽原花青素能減少糖尿病組小鼠腎組織中α-SMA、p38MAPK和ERK1/2蛋白表達，尿中8-OHdG水平也明顯降低，而E-cadherin蛋白表達增高(P<0.05)。結論 葡萄籽原花青素抑制腎小管上皮細胞-間質轉化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)生成，可能是通過抑制活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成，抑制p38MAPK和ERK1/2信號通路激活而實現的。葡萄籽原花青素對糖尿病腎病具有防治作用。

糖尿病腎病；上皮-間質轉化；葡萄籽原花青素；α-SMA；E-cadherin

研究表明，db/db小鼠腎組織中系膜基質的蓄積、小管上皮-間質轉化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)與活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成過多關系密切，主要表現在ROS對組織和細胞的毒性損傷[1-2]。另外，ROS還可作為細胞內信使，活化許多信號傳導通路，間接導致組織和細胞的損傷[3-4]。因此，抗氧化治療可有效減緩多種并發癥的發生[5]。本組前期實驗結果亦顯示，高糖能夠使人腎小管上皮細胞及小鼠系膜細胞中ROS增多，同時減少E-cadherin的表達；抗氧化劑NAC能夠減少高糖誘導的HK-2中ROS及α-SMA的過表達[6]。天然藥物葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract, GSPE)是天然的抗氧化劑，具有抗炎、抗凋亡、降血糖、降血脂抗氧化等作用[7-8]。然而，其作用的分子機制尚未完全清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物實驗 6～8周齡健康雄性C57BL/ks db/db小鼠，體重(40.0±2.5)g。16只及雄性體重(27±1.6)g的C57BL/ks db/m對照小鼠，購自常州卡文斯實驗動物公司。飼養環境為每籠8只，溫度為(22±2)℃，相對濕度為(55±2)%。適應性飼養1周。實驗開始后，16只雄性db/db小鼠隨機分為2組：糖尿病組(db/db組)、糖尿病+葡萄籽原花青素灌胃組(db/db+GSPE組)，每組各8只；相同周齡雄性8只db/m小鼠作為正常對照組(db/m組)及8只db/m小鼠+葡萄籽原花青素灌胃治療對照組(db/m+GSPE組)。db/db+GSPE組和db/m+GSPE組以葡萄籽原花青素(5 mg/kg)灌胃，每天灌胃1次，對照組和糖尿病組以等體積生理鹽水灌胃，持續12周。1.1.2 試劑 兔抗α-SMA、E-cadherin、p-p38MAPK、p38MAPK、p-ERK1/2和ERK1/2多克隆抗體(美國Cell Signaling公司)。兔抗α-SMA和E-cadherin多克隆抗體(美國Abcam公司)。SYBR Premix Ex TaqTMII(日本Takara公司)。兔抗α-actin多克隆抗體(上海藍基生物公司)。小鼠尿8-OHdG檢測試劑盒(中國南京建成試劑公司)。引物序列由上海生工設計合成。18S引物序列：F 5′-ACACGGACAGGATTGACAGA-3′，R 5′-GGACATCTAAGGGCATCACAG-3；α-SMA引物序列：F 5′-CGCCCTCGCCACCAGATCTG-3′，R 5′-TAGCCTTCATAGATGGGGAC-3′；E-cadherin引物序列：F 5′-GCCGGAGCCCTGCCACCCTG-3′，R 5′-CTTTCTGTAGGTGGAGTCCC-3′。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法檢測小鼠尿中8-OHdG的水平 先后加入稀釋后的標準品50 μL、待測樣品40 μL于反應孔內，立即加入抗8-OHdG抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育60 min。甩去孔內液體，震蕩洗滌5次，每次30 s。每孔加入顯色劑A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育10 min，避免光照。取出酶標板，迅速加入50 μL終止液，立即測定結果。在450 nm波長處測定各孔的OD值。結果判斷：以標準品的吸光度OD值為縱坐標，相應標準品濃度為橫坐標，做出相應曲線，樣品含量根據其OD值由標準曲線換算出相應濃度。

1.2.2 免疫組化法檢測腎組織表型相關蛋白表達 采用免疫組化SP法進行檢測。制備腎組織石蠟切片，切片常規脫蠟至水，3%H2O2甲醇溶液室溫孵育10 min，封閉內源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗2次，每次5 min，切片加入抗原修復液(0.01 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 6.0)，采用高溫高壓抗原修復法，修復10 min，室溫下冷卻45 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入正常山羊血清，37 ℃ 30 min封閉內源性生物素，甩掉血清滴加兔抗E-cadherin、α-SMA多克隆抗體(1 ∶150)，4 ℃孵育過夜，次日取出切片，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色，光鏡下觀察并控制顯色程度，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，陽性部位呈棕黃色，脫水透明，中性樹膠封固。以PBS替代一抗作為陰性對照。結果判定：α-SMA、E-cadherin陽性染色呈棕黃色或棕褐色，位于細胞質或細胞膜。根據陽性細胞百分比制定如下判定標準：<10%陽性細胞為陰性，>10%陽性細胞為陽性。

1.2.3 Western blot法檢測p-p38、p38、p-ERK1/2和ERK1/2表達 生理鹽水清洗小鼠腎組織后研磨成勻質，加入組織裂解液(25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，體積分數0.01 NP-40，150 mmol/L氯化鈉，質量濃度1 g/L苯甲基磺酰氟)，冰浴2 h，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，Lowry法測定上清液蛋白濃度。組織裂解蛋白40 μg，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后電轉移至PVDF膜；質量分數0.05的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入抗β-actin抗體(稀釋比例1 ∶1 000)、p-p38(稀釋比例1 ∶1 000)、p38(稀釋比例1 ∶1 000)、p-ERK1/2(稀釋比例1 ∶1 500)和ERK1/2(稀釋比例1 ∶2 000)抗體，4 ℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔抗體(1 ∶4 000稀釋)，37 ℃孵育2 h；洗膜后加ECL試劑，ODYSSEY遠紅外雙色熒光成像系統顯影(LI.COR Gene Company,USA)。用美國UVP公司LabWorks 4.5分析系統軟件對Western blot條帶進行定量分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測腎皮質中α-SMA和E-cadherin mRNA的表達 液氮研磨小鼠腎組織后Trizol法提取細胞總RNA，進行反轉錄。實時熒光定量PCR步驟：采用20反應體系，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (2×) 10，ROX Reference Dye (50×)0.4，反轉錄產物2，上、下游引物(終濃度為1 ng/mL)各0.8，雙蒸水6。反應條件：95 ℃ 30 s →95 ℃ 5 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，共40個循環。根據比較法計算基因表達相對量，采用公式2-ΔΔCt計算基因表達的相對倍數變化。

2 結果

2.1 各組小鼠血、尿生化指標檢測結果(表1) 與對照組相比，糖尿病組小鼠尿蛋白(Upro)及尿8-OHdG明顯升高；糖尿病db/db小鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)及血中甘油三酯(TG)比對照組db/m小鼠增加(P<0.05)。給予葡萄籽原花青素治療后血中FBG、Scr、BUN、TG及尿液中8-OHdG、尿蛋白與db/db組比較含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 葡萄籽原花青素對糖尿病腎組織中α-SMA、E-cadherin表達的影響 免疫組化檢測結果：db/m組中，α-SMA表達于血管壁，在腎小管細胞胞質中有少量表達、E-cadherin在腎小管細胞質及細胞膜中大量表達；db/db組中，α-SMA在腎小管上皮細胞胞質中大量表達、E-cadherin在腎小管細胞質及細胞膜中表達明顯減少(圖1)；葡萄籽原花青素灌胃組中α-SMA表達減少，E-cadherin表達明顯增多(圖1)。

表1 小鼠各組血、尿液生化指標的檢測±s)

與db/m組相比，**P<0.01；與db/db組相比，#P<0.05，##P<0.01

ABCDα?SMAE?cadherin

圖1 小鼠腎組織中α-SMA和E-cadherin蛋白表達變化

A.db/m組；B.db/m+GSPE組；C.db/db組；D.db/db+GSPE組

2.4 葡萄籽原花青素對腎組織p-p38MAPK和p-ERK1/2信號通路的影響 與db/m對照組比較，db/db組小鼠腎組織中p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達明顯增加；與db/db組小鼠比較，葡萄籽原花青素組腎組織中p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達減少(P<0.05或P<0.01，圖2)

2.5 實時熒光定量PCR結果 與db/m組比較，db/db組小鼠腎組織α-SMA mRNA表達明顯增加，E-cadherin表達減少；與db/db組小鼠組比較，葡萄籽原花青素組腎組織中α-SMA mRNA表達減少，E-cadherin mRNA表達增多(P<0.01或P<0.05，圖3)。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病常見的嚴重并發癥，其發病機制十分復雜，目前認為出現糖尿病時，大量ROS的蓄積造成的氧化應激狀態，參與其發生、發展。而腎小管EMT是導致糖尿病腎損傷的主要機制之一。EMT過程中是上皮細胞失去特征性標志物的表達，同時獲得間質標志物表達及伴有細胞形態呈纖維細胞樣的改變[1]。其中主要包括了間質細胞標志物α-SMA表達增加、E-cadherin表達減少。研究已證實[9]，慢性高血糖狀態誘發的氧化應激在糖尿病腎損傷過程中發揮重要作用，活性氧自由基的產生使腎小管上皮細胞表型改變，推動糖尿病腎病的發生、發展。因此，有效阻斷氧化應激、尋找開發有效藥物將是防治糖尿病慢性腎病變的重要途徑。

葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提取的一種天然多酸類化合物，是一種很好的氧自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑，能有效地清除超氧陰離子和自由基，中斷自由基鏈式反應[10]。本組結果顯示，在12周的干預實驗中，葡萄籽原花青素能夠顯著降低db/db小鼠尿中ROS(8-OHdG)的產生。同時還發現，給予葡萄籽原花青素治療后，小鼠α-SMA表達與糖尿病db/db組小鼠比較顯著降低，而E-cadherin表達顯著增加。提示，抗氧化劑葡萄籽原花青素可以降低db/db小鼠腎小管上皮細胞EMT生成，可能與ROS的產生有關。本組的前期研究結果也表明，抗氧化劑NAC能夠減少高糖誘導的EMT生成，通過抑制ROS的產生、抑制p38MAPK和ERK1/2活化來實現[6]。ECM在腎小球系膜區和腎小管間質的過度沉積與糖尿病腎功能進行性下降密切相關，腎病腎間質損傷在糖尿病腎病進展過程中比腎小球損傷更為嚴重，并且普遍認為EMT可能是糖尿病腎病腎間質纖維化的最重要因素之一[11]。Li等[12]研究表明，葡萄籽原花青素B2能夠通過甲基轉移酶沉默或LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞中ERK、GSK3β磷酸化水平降低。也有研究表明[13]，葡萄籽原花青素B2通過ERK和p38MAPK信號通路和Nrf2的易位機制，調控谷胱甘肽轉移酶的活性保護結腸Caco-2細胞免受氧化損傷。本組實驗發現，db/db組小鼠p38MAPK與ERK1/2的磷酸化水平明顯升高，而葡萄籽原花青素組p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平降低。提示，在糖尿病db/db小鼠模型中p38MAPK、ERK信號通路參與了細胞轉分化的過程，而抗氧化劑葡萄籽原花青素可以抑制p38MAPK、ERK信號通路的激活。

圖2 小鼠腎組織中p-ERK1/2、ERK1/2、p38和p-p38蛋白的表達

A.電泳圖；B.直方圖；1.db/m組；2.db/m+GSPE組；3.db/db組；4.db/db+GSPE組。與db/m組相比，**P<0.01；與db/db組相比，#P<0.05

圖3 小鼠腎組織中α-SMA(A)和E-cadherin(B)mRNA的表達

1.db/m組；2.db/m+GSPE組；3.db/db組；4.db/db+GSPE組。與db/m組相比，**P<0.01；與db/db組相比，#P<0.05

葡萄籽原花青素的抗氧化活性使其可抑制高血糖、脂肪酸過氧化等過氧化應激損傷時TNF-α、IL-1等炎性細胞因子的合成和釋放，抗炎機制和清除氧自由基、抗脂質過氧化和減少細胞因子的生成有關[14-15]。本實驗結果也發現，葡萄籽原花青素能夠明顯減少db/db小鼠血糖，降低Scr、BUN和高脂血癥，降低db/db小鼠的尿8-OHdG水平。提示，葡萄籽原花青素治療通過抑制血糖、尿8-OHdG水平等方面發揮作用。其與當前的研究結果相一致[8]。

總之，本組實驗結果表明，葡萄籽原花青素拮抗db/db糖尿病小鼠腎小管上皮細胞EMT生成，可能是通過抑制ROS的產生及抑制p38 MAPK和ERK1/2活化實現的。但分子機制仍不完全清楚。

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Effect of grape seed proanthocyanidins on phenotype marker protein ofrenal cells in db/db mice

WEI Jin-ying, SHI Yong-hong, REN Yong-zhuo, DU Yun-xia, DU Chun-yang, DUAN Hui-jun, WU Hai-jiang

(DepartmentofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Purpose To investigate the effect of grape seed proanthocyanidins on the phenotype-transforming marker protein expression of db/db renal cells in mice model of type 2 diabetes, and to explore the protective mechanism of grape seed extract on diabetic renal injury in db/db mice. Methods Male db/db diabetic mice were randomly divided into two groups: diabetic group (db/db group) and diabetic+grape seed proanthocyanidin extract group (db/db+GSPE). The same week-old male db/m mice was used as normal controls (db/m) and grape seed proanthocyanidin extract gavage treatment group (db/m+grape seed proanthocyanidin extract group, db/m+GSPE). The mice of db/db+GSPE group and db/m+GSPE group were administered daily with grape seed proanthocyanidin extract (5 mg/kg) by gavage. Results Renal tissues of db/db diabetic mice showed increased expression of α-SMA, p-p38MAPK, p-ERK1/2 and 8-OHdG level, and down-regulation in E-cadherin expression compared with db/m group (P<0.05). However, the alternations of α-SMA, p-p38, p-ERK1/2, E-cadherin protein levels, and 8-OHdG level, in db/db group were reversed by addition of grape seed proanthocyanidin extract (P<0.05). Conclusion Grape seed proanthocyanidin extract inhibits the epithelial to mesenchymal transition (EMT) associated protein, by decreasing ROS production, and activating p38 MAPK and ERK1/2. These findings suggest that grape seed proanthocyanidin extract provides a treatment option for diabetic nephropathy.

diabetic nephropathy; epithelial to mesenchymal transition; grape seed proanthocyanidin extract; α-SMA; E-cadherin

河北省自然科學基金(H2016206482)、河北省高等學校科學技術研究項目(QN2015020)

河北醫科大學病理學教研室，石家莊 050017

韋金英，女，博士，副教授。Tel: (0311)86265724，E-mail: wjy-sss@126.com 吳海江，男，博士，副教授，通訊作者。E-mail: haijianglaoqi@163.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.007.html

R-332

A

1001-7399(2017)08-0858-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.007

接受日期：2017-05-24