Necrostatin-1對輸尿管梗阻小鼠腎臟炎癥的影響

肖 夏，張 濤，楊昕達，滕 晴，侯 佳，任韞卓

Necrostatin-1對輸尿管梗阻小鼠腎臟炎癥的影響

肖 夏1，張 濤2，楊昕達1，滕 晴1，侯 佳1，任韞卓1

目的 探討necroptosis(壞死性凋亡)抑制劑Necrostatin-1(Nec-1)對單側輸尿管梗阻(unilateral ureter obstruction, UUO)小鼠腎臟炎癥的影響。方法 雄性C57BL/6J小鼠隨機分為假手術組(Sham組)、左側輸尿管結扎組(UUO組)、UUO+Nec-1治療組(UN組)，術后7天處死小鼠取左腎。收集血清測定肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平；HE染色觀察腎臟形態學改變；免疫組化法和Western blot法分別檢測腎臟組織中壞死性凋亡相關指標RIP1、RIP3、MLKL以及炎癥相關因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的表達。結果 與Sham組相比，UUO組小鼠RIP1、RIP3和MLKL蛋白表達明顯升高，同時伴有TNF-α、IL-1β、MCP-1表達增多。Nec-1治療顯著降低了上述蛋白的表達水平，同時HE染色顯示腎間質炎性反應和腎小管損傷程度有所減輕，Scr和BUN水平提示腎功能有所改善。結論 Nec-1通過抑制necroptosis減輕了單側輸尿管梗阻小鼠腎臟的炎癥反應，這可能成為治療腎臟繼發炎癥的新靶點。

炎癥；輸尿管梗阻；Necrostatin-1；necroptosis

腎間質的炎癥反應是多種腎臟疾病發生、發展的病理生理基礎，在輸尿管梗阻和其他疾病導致的進行性腎間質纖維化中發揮重要的促進作用。有效抑制炎癥反應，對疾病的預后有重要意義。炎癥反應的發生機制和多種因素有關，其中壞死被認為是引起炎癥的主要因子。necroptosis[1]通常被譯作“壞死性凋亡”，是一種非caspase依賴的可調控的細胞程序性壞死途徑。新近研究發現，necroptosis能夠誘發炎癥反應，促使組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1等多種炎癥因子表達上調[2]，并與多種腎臟損傷性疾病密切相關。而necroptosis在單側輸尿管梗阻導致的腎間質炎癥反應中發揮怎樣的作用，尚未見報道。Necrostatin-1(Nec-1)是necroptosis的特異性阻斷劑，通過作用于necroptosis的特異性分子標志物RIP1和RIP3的激酶活性部位，抑制其相互磷酸化從而抑制necroptosis[1-3]。本實驗通過建立經典的單側輸尿管梗阻(UUO)小鼠模型，給予Nec-1治療，觀察necroptosis在腎臟炎癥反應中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑 Nec-1購自MedChem Express公司，兔多克隆抗體RIP1、RIP3、MLKL、MCP-1、IL-1β購自Abcam公司，兔多克隆抗體TNF-α購自Novusbio公司。SP三步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。RIPA裂解液購自上海貝博生物公司。BCA試劑盒購自Solarbio公司。血肌酐(Scr)測定試劑盒、尿素氮(BUN)測定試劑盒購自中生北控生物公司。

1.2 動物模型 12只雄性C57BL/6J小鼠，質量約25 g。按隨機區間法分為假手術組(Sham組，n=4)、左側輸尿管結扎組(UUO組，n=4)、UUO+Nec-1治療組(UN組，n=4)。UUO組和UN組在無菌條件下行左側輸尿管結扎術，完全梗阻左腎，Sham組除不結扎輸尿管外同模型組做相同處理。UN組自手術日起，每天給予Nec-1 150 μL(0.1 μg/μL)腹腔注射治療。術后第7天腹腔麻醉后切除左腎，留取腎門處橫斷面的腎組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋制成3 μm厚石蠟切片用于病理染色，剩余腎組織迅速置液氮后-80 ℃保存。

1.3 HE染色 石蠟切片行常規HE染色，觀察3組腎組織的病變情況。

1.4 腎功能測定 采用RT-9600半自動生化分析儀(美國雷杜)測定Scr和BUN水平。

1.5 免疫組化 3 μm厚石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2甲醇封閉20 min，高壓修復，山羊血清37 ℃封閉30 min，一抗RIP1(1 ∶400)、RIP3(1 ∶1 000)、MLKL(1 ∶400)4 ℃過夜，后二抗、三抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹脂封固。每組均以PBS代替一抗作陰性對照。

1.6 Western blot法 用RIPA裂解液提取腎皮質總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，50 μg每孔上樣，10%～12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳90～120 min后轉膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，一抗RIP1(1 ∶400)、RIP3(1 ∶1 000)、MLKL(1 ∶500)、MCP-1(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶2 000)、TNF-α(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，β-actin(1 ∶2 000)作為內參照，二抗(1 ∶5 000)37 ℃孵育1 h。采用ODYSSEY遠紅外雙色熒光成像系統顯影，Image J圖像分析軟件分析電泳條帶灰度，各目的蛋白條帶與其對應內參的灰度比值代表樣品蛋白表達的相對量。

2 結果

2.1 HE染色 Sham組腎組織形態未見異常。UUO組可見部分腎小管上皮細胞腫脹，嚴重者發生空泡變性，部分腎小管明顯擴張，腎間質增寬，并伴有炎細胞浸潤。UN組腎小管上皮細胞水腫減輕，擴張腎小管數量減少，腎間質炎性浸潤有所改善(圖1)。

2.2 腎功能測定 與Sham組相比，UUO組小鼠Scr和BUN升高，而UN組Scr和BUN降低，提示腎功能有所改善(表1)。

2.3 免疫組化檢測necroptosis特異性分子標志物RIP1、RIP3、MLKL的表達 RIP1在Sham組遠曲小管上皮細胞胞質中有少量表達，在UUO組大量遠曲小管上皮細胞胞質和細胞核中均有表達，而UN組RIP1在遠曲小管的表達明顯減少。Sham組近曲小管胞質中有微弱的RIP3陽性信號，UUO組RIP3在近曲小管胞質中呈強陽性，Nec-1處理后其陽性信號明顯減弱。MLKL在Sham組腎小管游離面刷狀緣有微量表達，單側輸尿管結扎后腎小管細胞胞質和胞核中均有明顯的MLKL表達，但在UN組小管細胞胞質和胞核中表達均顯著減少(圖2)。

表1 各組小鼠血清Scr和BUN水平

與Sham組相比，**P<0.01；與UUO組相比，##P<0.01

2.4 Western blot檢測結果

2.4.1 Nec-1對necroptosis特異性分子標志物RIP1、RIP3、MLKL的影響 建模第7天，UUO組腎組織中RIP1、RIP3、MLKL蛋白表達水平均較Sham組升高，提示UUO小鼠梗阻腎發生了necroptosis；給予Nec-1治療后，UN組RIP1、RIP3、MLKL表達量較UUO組顯著下降，提示該劑量Nec-1治療可抑制necroptosis的發生(圖3)。

2.4.2 Nec-1治療減少UUO小鼠腎組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的表達 建模第7天，Sham組腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1均微弱表達，UUO組三者的表達較Sham組顯著上調；應用Nec-1治療后，UN組TNF-α、IL-1β、MCP-1的表達明顯降低(圖4)。

3 討論

細胞壞死以細胞膜崩解、細胞器腫脹、線粒體功能喪失為主要特征，并引起嚴重的炎癥反應，存在于各種病理生理過程中，但因其不可調控而未受重視。

Sham組UUO組UN組ABC

圖1 HE染色小鼠腎組織形態學改變：A.Sham組未見異常；B.UUO組腎小管水腫、擴張，間質炎性浸潤； C.UN組腎小管間質病變改善

圖2 各組小鼠腎組織中RIP1、RIP3、MLKL的表達，SP三步法

圖3 Western blot法檢測各組小鼠腎組織中 RIP1、RIP3、MLKL的表達

A.電泳圖；B.直方圖；與Sham組比較，**P<0.01；與UUO組比較，##P<0.01，#P<0.05

圖4 Western blot法檢測各組小鼠腎組織中 IL-1β、MCP-1、TNF-α的表達

A.電泳圖；B.直方圖；與Sham組比較，**P<0.01；與UUO組比較，##P<0.01

2005年由Degterev等[1]首次報道了一種新型的細胞死亡模式——necroptosis，其具有壞死細胞特征，卻是可調控的，Caspase非依賴的程序性細胞死亡，并常伴大量炎細胞浸潤。當細胞凋亡途徑中Caspase 8功能障礙或被藥物阻斷時，相應配體(如TNF)[4]激活死亡結構域(DD)，使上游形成的復合物中的RIP1和RIP3緊密結合并相互磷酸化，活化的RIP3進一步導致其底物MLKL等蛋白磷酸化繼而引發下游信號通路，啟動necroptosis途徑。RIP1-RIP3復合物的形成和磷酸化是necroptosis的關鍵性和特異性步驟[5]，對necroptosis的特異性分子標志物RIP1、RIP3以及RIP3的下游分子MLKL進行檢測，可以證明necroptosis的發生[1-3]。有研究顯示，necroptosis參與多種炎癥反應的發生[2]，在很多動物模型，如小鼠慢性自身免疫性皮膚炎[6]，小鼠心肌缺血再灌注心肌細胞的氧化應激[7]，小鼠痘病毒感染的炎癥反應[8]以及臨床Crohn病[9]中發揮重要作用。對necroptosis進行適當干預，可能減輕病變組織的炎癥反應，減緩疾病進程。

Nec-1是necroptosis的特異性阻斷劑，其作用于RIP1和RIP3的激酶活性部位，抑制其相互磷酸化以及RIP1-RIP3復合物的形成和RIP3的激活，從而抑制necroptosis的發生[1-3]，在研究中被廣泛使用。新近研究顯示,在小鼠急性肺損傷模型中，應用Nec-1可以減輕中性粒細胞依賴的炎癥反應[10]；在心肌缺血再灌注模型以及冠脈永久性結扎缺血模型中Nec-1能夠有效減少心肌細胞炎性損傷[11]。

本組UUO小鼠建模7天時，RIP1、RIP3、MLKL水平比Sham組明顯上調，說明UUO小鼠7天腎組織中發生了necroptosis；而Nec-1治療后，UN組RIP1、RIP3、MLKL表達水平顯著下降，提示Nec-1有效抑制了UUO腎組織中的necroptosis途徑，為后續觀察necroptosis對炎癥反應的作用創造了可靠的前提條件。

在UUO模型中，腎間質的炎癥反應以及炎癥繼發的纖維化是主要的病理過程[12]。該模型中腎間質浸潤的炎細胞主要是巨噬細胞和淋巴細胞。TNF-α主要由間質浸潤的巨噬細胞和腎小管上皮細胞產生，可導致多種致炎因子爆發性釋放，促進炎細胞趨化浸潤。IL-1β主要由巨噬細胞分泌，參與免疫細胞的激活，促進炎細胞的聚集與黏附，微血管擴張和通透性增加，誘發炎癥反應。MCP-1是重要的巨噬細胞特異性趨化因子，既可以趨化炎癥，又可以促進固有細胞釋放炎癥介質，從而放大炎癥反應。通過上述3種炎癥因子，可以有效監測UUO腎間質的炎癥反應[13]。

本組實驗從組織形態學觀察可以發現，Nec-1治療后腎小管的水腫和擴張均有所減輕，腎間質變窄，炎性浸潤有所緩解。Western blot結果顯示，與Sham組相比，UUO組7天腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1的表達量均明顯增加；而在UN組，Nec-1的治療明顯減少了UUO腎組織中TNF-α、IL-1β和MCP-1的表達量。由此說明Nec-1抑制necroptosis途徑后可顯著緩解UUO腎臟的炎癥反應。

新近研究報道稱，RIP3可以促進IL-1β炎癥反應而不激活下游的MLKL[14]。因此，在necroptosis參與UUO炎癥反應的過程中，究竟是何種蛋白或信號通路起關鍵作用，又是如何參與炎癥反應的，以及對炎癥繼發的腎間質纖維化起何種作用，仍待后續研究。但在初步研究中，Nec-1抑制necroptosis從而減輕UUO小鼠腎間質炎癥反應的作用已經明了，這可能成為治療腎間質炎癥病變的新靶點。

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Effect of Necrostatin-1 on the inflammation in unilateral ureter obstruction mice

XIAO Xia1, ZHANG Tao2, YANG Xi-da1, TENG Qing1, HOU Jia1, REN Yun-zhuo1

(1DepartmentofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2DepartmentofNephrology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

Purpose To observe the effect of Necrostatin-1(Nec-1), a necroptosis inhibitor, on the inflammation in unilateral ureter obstruction mice. Methods Male C57BL/6J mice were randomly divided into sham operation group, unilateral ureter obstruction operation group and UUO+Nec-1 treatment group, and the mice were sacrificed at 7th day after operated. Scr and BUN were measured. The pathological changes in the kidney were observed by HE staining. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the protein expression of necroptosis-related indicators RIP1, RIP3, MLKL and inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and MCP-1. Results Compared with sham operation group, the expression of RIP1, RIP3 and MLKL protein increased in the renal tissue of UUO mice, accompanied with increased expression of TNF-α, IL-1β and MCP-1. Nec-1 treatment significantly decreased above-mentioned protein expression in UUO mice, and also reduced renal interstitial inflammation and renal tubal injury according to HE staining. Scr and BUN levels suggested improved renal function. Conclusion Nec-1 could relieve the inflammatory reaction in renal tissue of the UUO mice by inhibiting necroptosis, which may be a new target for the treatment of secondary inflammation.

inflammation; ureteral obstruction; Necrostatin-1; necroptosis

河北省首批青年拔尖人才項目(QNBJ16002)、河北省衛生廳重點科技研究計劃(20150628)、河北省博士后科研資助項目(B2015003028)

1河北醫科大學病理學教研室，石家莊 0500172河北醫科大學第三醫院腎內科，石家莊 050000

肖 夏，女，碩士研究生。E-mail: xiaoxia_63@163.com 任韞卓，女，博士，教授，通訊作者。E-mail: renyunzhuo 1978@163.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.008.html

R-332； R 692.2

A

1001-7399(2017)08-0863-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.008

接受日期：2017-04-17