小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞和腫瘤組織中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)及意義

欒雅靜，鄭 旭，仇曉菲

小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞和腫瘤組織中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)及意義

欒雅靜，鄭 旭，仇曉菲

目的 觀察小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞和腫瘤組織中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)，并探討其臨床意義。方法 采用干細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)富集小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446第3代腫瘤球細(xì)胞作為腫瘤干細(xì)胞；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)H446干細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α mRNA的表達(dá)；免疫熒光法檢測(cè)H446干細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)；免疫組化SP法檢測(cè)小細(xì)胞肺癌組織中HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)。結(jié)果 小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞HIF-2α mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，而HIF-1α mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中HIF-2α蛋白呈陽(yáng)性，而HIF-1α蛋白呈陰性；小細(xì)胞肺癌組織中HIF-1α的陽(yáng)性率為46.7%(28/60)，HIF-2α陽(yáng)性率為25%(15/60)。相關(guān)分析結(jié)果顯示HIF-2α與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物uPAR呈正相關(guān)且兩者共同表達(dá)于小細(xì)胞肺癌壞死組織周圍區(qū)域；HIF-2α與小細(xì)胞肺癌腫瘤直徑和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而HIF-1α與患者年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 HIF-2α在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)且與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物uPAR呈正相關(guān)，與小細(xì)胞肺癌腫瘤直徑和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示HIF-2α表達(dá)可能與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞樣特征有關(guān)。關(guān)鍵詞：肺腫瘤；小細(xì)胞肺癌；腫瘤干細(xì)；HIF-1α；HIF-2α

小細(xì)胞肺癌又稱小細(xì)胞未分化癌，是肺癌中惡性程度最高的類型，占全部肺癌的10%～20%。具有惡性度高、進(jìn)展快、全身播散和預(yù)后差等特點(diǎn)。

惡性腫瘤在生長(zhǎng)過程中，由于腫瘤細(xì)胞過度增殖需要高度消耗能量，從而引起局部組織供氧與耗氧失衡，形成腫瘤組織缺氧微環(huán)境。缺氧與腫瘤患者放、化療抵抗，增加轉(zhuǎn)移潛能和不良預(yù)后有關(guān)[1-3]。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和HIF-2α在這些轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[4]。雖然HIF-1α和HIF-2α高度同源，由于它們獨(dú)特的靶基因及不同的需氧條件，經(jīng)常起著非冗余的生物學(xué)角色[5]。研究顯示，在缺氧狀態(tài)下，HIF-2α及其特異性調(diào)控的靶基因(OCT-4、SerpinB9)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的表達(dá)顯著高于非腫瘤干細(xì)胞。有趣的是，數(shù)據(jù)表明HIF-2α優(yōu)先在腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)，參與干細(xì)胞的調(diào)節(jié)[6-8]。然而，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和HIF-2α在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞的表達(dá)及其與小細(xì)胞肺癌的臨床意義鮮有研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，美國(guó))；RPMI 1640培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺、Trizol和SYBR Green(Real Master Mix)試劑盒購(gòu)自天津潤(rùn)泰科技公司；胎牛血清購(gòu)自HyClone公司；表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維生長(zhǎng)因子購(gòu)自PeproTech公司；SuperScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen公司；牛血清白蛋白購(gòu)自天津津脈基因測(cè)繪公司；反轉(zhuǎn)錄引物和上、下游引物由天津賽爾生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng) 體外無血清培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞球參考Dontu等[9]的標(biāo)準(zhǔn)。H446細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)90%融合后，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞，再將H446單細(xì)胞懸液以105/mL的密度置于含有無血清培養(yǎng)基的超低吸附培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得懸浮腫瘤細(xì)胞球。無血清培養(yǎng)基由DMEM/F12、B27(1 ∶50)，20 ng/mL EGF、bFGF、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.4%BSA、5 μg/mL胰島素、1%KO-血清替代物和0.8%甲基纖維素。待腫瘤球生長(zhǎng)到一定體積后，通過自由沉淀或者低速離心法收集培養(yǎng)板內(nèi)腫瘤球，然后經(jīng)0.125%胰酶消化，吸管反復(fù)吹打至成單細(xì)胞懸液后進(jìn)行傳代。以下實(shí)驗(yàn)均使用第3代腫瘤細(xì)胞球。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按SYBR Green (Real Master Mix)試劑盒說明書分別檢測(cè)HIF-1α、HIF-2α、OCT-4、SOX2、NANOG和c-MYC的mRNA表達(dá)量。HIF-1α引物序列：5′-GAAACCACCTATGACCTGC-3′、5′-CTGTTTGTTGAAGGGAGAA-3′，目的片段長(zhǎng)度434 bp；HIF-2α引物序列：5′-TGAAAACGAGT CCGAAGCC-3′、5′-GTGGCTGACTTGAGGTTGA-3′，目的片段長(zhǎng)度342 bp；OCT-4引物序列：5′-GCTC GAGAAGGATGTGGTCC-3′、5′-CGTTGTGCATAGTCG CTGCT-3，目的片段長(zhǎng)度81 bp；SOX2引物序列：5′-CACTGCCCCTCTCACACATG-3′、5′-TCCCATTTCCCT CGTTTTTCT-3′，目的片段長(zhǎng)度82 bp；NANOG引物序列：5′-ACCTGGAGCAACCAGACCCAGA-3′、5′-GC TTCCAAGGCAGCCTCCAAGT-3′，目的片段長(zhǎng)度194 bp；c-myc引物序列：5′-AAAGACAGCGGCAGCC CGAA-3′，5′-TCTTGCGAGGCGCAGGACTT-3′，目的片段長(zhǎng)度167 bp；相對(duì)定量用2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)。Ct1：干細(xì)胞基因臨界循環(huán)數(shù)、Ct2：干細(xì)胞管家基因臨界循環(huán)數(shù)、Ct3：親本細(xì)胞基因臨界循環(huán)數(shù)、Ct4：親本細(xì)胞管家基因臨界循環(huán)數(shù)。

1.2.3 免疫熒光 免疫熒光染色方法參考文獻(xiàn)[10]。通透化處理：將滴片取出，室溫恢復(fù)10 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，0.1%Triton-X100室溫孵育15 min；封閉：將滴片浸入含有5%FBS的PBS溶液中，37 ℃ 30 min；滴加一抗，4 ℃過夜；滴加FITC標(biāo)記二抗，37 ℃ 1 h，PBS洗5 min×3次，此步之后需注意避光操作；染核：DAPI染核，37 ℃ 5 min，95%乙醇洗1遍，PBS洗3遍；將淬滅劑滴1滴至載玻片，蓋玻片蓋其上，激光共聚焦顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，每次至少數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記錄陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/100，結(jié)果用3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示。

1.2.4 免疫組化 免疫組化染色采用EnVision兩步法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；自來水沖洗5 min，蒸餾水沖洗3次；枸櫞酸緩沖液(0.01 mol/L pH 6.0)，微波95～98 ℃，維持15 min后室溫自然冷卻，自來水沖洗5 min，蒸餾水沖洗3次，PBS洗3×5 min；正常山羊血清封閉，室溫30 min；滴加一抗，室溫放置30 min，濕盒內(nèi)4 ℃冰箱過夜；次日晨取濕盒，放置室溫50 min，PBS洗5 min×3，滴加EnVision二抗，室溫孵育30 min，PBS洗5 min×3次，平放于濕盒中；DAB顯色；蘇木精復(fù)染胞核；常規(guī)脫水、透明；中性樹膠封固。

1.2.5 免疫組化結(jié)果判定 采用半定量積分法，即根據(jù)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞比例及著色程度評(píng)分。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，10%～30%為2分，30%以上為3分；(2)按著色程度評(píng)分：未著色為0分，淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為(-)；1～2分為(+)；3～4分為()；4分以上為()。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Spearman秩相關(guān)方法分析HIF-1α/HIF-2α表達(dá)與uPAR的相關(guān)性，兩組定量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，兩組定性數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α mRNA的表達(dá) 本課題組前期工作證明小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446第3代腫瘤球細(xì)胞富集腫瘤干細(xì)胞，本組以第3代腫瘤球細(xì)胞作為腫瘤干細(xì)胞，以貼壁H446細(xì)胞作為對(duì)照組代表非干細(xì)胞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：與親代細(xì)胞相比，小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞HIF-2α mRNA的表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但HIF-1α mRNA表達(dá)水平反而下調(diào)(圖1A)，HIF-1α和HIF-2α mRNA表達(dá)水平呈互補(bǔ)特征。

2.2 小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 進(jìn)一步檢測(cè)HIF-2α下游靶基因OCT-4及其可能調(diào)控的干細(xì)胞基因在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中的表達(dá)，包括c-myc、SOX2和NONOG。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：與非干細(xì)胞相比，小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中HIF-2α的靶基因OCT-4 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B)，但其它干細(xì)胞基因SOX2、c-myc和NONOG mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α蛋白的表達(dá) 免疫熒光染色結(jié)果顯示：HIF-2α在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中呈陽(yáng)性，但在非干細(xì)胞中呈陰性(圖2)；與之相反，HIF-1α在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中呈陰性，在非干細(xì)胞中呈陽(yáng)性(圖2)，HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)也呈互補(bǔ)特征，即在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中HIF-2α表達(dá)上調(diào)，而HIF-1α表達(dá)下調(diào)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果一致；OCT-4在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中呈陽(yáng)性(圖2)。

圖1 A.小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞HIF-1α、HIF-2α和OCT-4 mRNA的表達(dá)；B.干細(xì)胞相關(guān)基因SOX2、c-myc和NONOG mRNA的表達(dá)；*P<0.05

2.4 小細(xì)胞肺癌組織中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá) 小細(xì)胞肺癌組織中HIF-1α的陽(yáng)性率為46.7%(28/60)，其中(+)10例，()12例，()6例。癌旁正常組織未見HIF-1α的表達(dá)。HIF-1α陽(yáng)性呈棕黃色，主要定位于腫瘤細(xì)胞核內(nèi)(圖3)，HIF-1α陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞在癌巢呈彌散性分布；HIF-2α的陽(yáng)性率為25%(15/60)，其中(+)7例，()6例，()2例。癌旁正常組織中未見HIF-2α的表達(dá)。HIF-2α陽(yáng)性呈棕黃色，主要定位于腫瘤細(xì)胞核。HIF-2α陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞主要分布于小細(xì)胞肺癌壞死組織周圍區(qū)域(圖4A)。

2.5 HIF-2α表達(dá)與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物uPAR的相關(guān)性 本組前期工作證明uPAR為小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物，且在腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)。而本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HIF-2α在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞亦高表達(dá)。進(jìn)一步探討HIF-1α/HIF-2α表達(dá)與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物uPAR的相關(guān)性，Spearman相關(guān)性分析顯示：HIF-1α與uPAR表達(dá)無相關(guān)性(P=0.096，r=0.217，表1)，而HIF-2α與uPAR表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.001，r=0.409，表2)。為進(jìn)一步證實(shí)HIF-2α和uPAR在小細(xì)胞肺癌組織表達(dá)定位是否也具相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行HIF-2α和uPAR免疫組化連續(xù)切片染色。結(jié)果顯示HIF-2α與uPAR共同表達(dá)于小細(xì)胞肺癌壞死組織周圍區(qū)域(圖4)。

DAPIHIF?2αHIF?1αOCT?4腫瘤球H446

圖2 HIF-2α、HIF-1α和OCT-4在腫瘤球細(xì)胞和H446親代細(xì)胞中的表達(dá)，免疫熒光染色

圖3 HIF-1α在小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中的表達(dá)，EnVision兩步法 圖4 HIF-2α與uPAR共同表達(dá)于小細(xì)胞肺癌壞死組織周圍區(qū)域：A.HIF-2α；B.uPAR，EnVision兩步法

表1 HIF-1α和uPAR表達(dá)的相關(guān)性

表2 HIF-2α和uPAR表達(dá)的相關(guān)性

*P<0.05

2.6 HIF-1α和HIF-2α表達(dá)與小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系 將患者年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與HIF-1α和HIF-2α表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示，HIF-2α與腫瘤直徑和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(表3)。隨著腫瘤體積的增大，HIF-2α表達(dá)隨之增高(P<0.05)；HIF-2α陽(yáng)性組患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高于HIF-2α陰性組(P<0.05)。HIF-1α表達(dá)與以上臨床病理參數(shù)均無關(guān)(P>0.05，表3)。

3 討論

本課題組前期工作證明小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446第3代腫瘤球細(xì)胞富集腫瘤干細(xì)胞，進(jìn)一步證明uPAR可能為小細(xì)胞肺癌的干細(xì)胞標(biāo)志物[11]。有趣的是，文獻(xiàn)報(bào)道[3,12]缺氧微環(huán)境能夠誘導(dǎo)uPAR的表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明，缺氧微環(huán)境可能是干細(xì)胞壁龕的關(guān)鍵組成部分[13]。缺氧能夠維持間充質(zhì)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和多潛能性[14-15]。Heddleston等[16]發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下非干神經(jīng)細(xì)胞成球率是常氧時(shí)的2倍，缺氧微環(huán)境在促進(jìn)和維持干細(xì)胞自我更新能力中起著重要角色。因此，作者提出這樣的問題：缺氧微環(huán)境中起關(guān)鍵作用的HIF-1α和HIF-2α在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中的表達(dá)如何？其表達(dá)與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞存在什么關(guān)系？

表3 HIF-2α和HIF-1α表達(dá)與小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HIF-2α在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，HIF-1α表達(dá)反而下調(diào)。新近研究表明HIF-2α在缺氧誘導(dǎo)的腫瘤干細(xì)胞維持中起到重要的作用。Li等[6]指出HIF-2α及其特異調(diào)節(jié)的靶基因OCT-4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中均顯著高于非干細(xì)胞，提示HIF-2α可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)因子。Seidel等[13]指出HIF-1α過表達(dá)對(duì)側(cè)群細(xì)胞(干細(xì)胞)標(biāo)記基因的表達(dá)無影響，而HIF-2α過表達(dá)能夠顯著上調(diào)側(cè)群細(xì)胞標(biāo)記基因和干細(xì)胞因子OCT-4的表達(dá)水平，并證實(shí)了缺氧壁龕通過HIF-2α來調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的干細(xì)胞特征。而且，確定關(guān)鍵的干細(xì)胞因子OCT-4和c-myc為HIF-2α的靶基因直接將HIF-2α與干細(xì)胞的生物學(xué)特征聯(lián)系起來[7,17]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HIF-2α在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致。進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-2α可能調(diào)控的干細(xì)胞因子OCT-4和c-myc，NONOG和SOX2在干細(xì)胞的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：僅HIF-2α的下游靶基因OCT-4在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。OCT-4在維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性和干細(xì)胞的自我更新中起重要作用[18]。Covello等[7]指出HIF-2α能夠連接到OCT-4的啟動(dòng)子上，誘導(dǎo)OCT-4的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活力，并證實(shí)OCT-4為HIF-2α直接調(diào)控的下游靶基因。本組中HIF-2α和OCT-4在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中的表達(dá)均上調(diào)，提示HIF-2α可能通過激活干細(xì)胞因子OCT-4的表達(dá)來維持腫瘤球的干細(xì)胞功能，以提供腫瘤球細(xì)胞更好的生長(zhǎng)和生存優(yōu)勢(shì)。小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)呈現(xiàn)相互抑制的互補(bǔ)關(guān)系。Raval等[19]指出，在腎透明細(xì)胞癌RCC4細(xì)胞系和SKRC28細(xì)胞系中HIF-2α顯著下調(diào)HIF-1α的表達(dá)；然而，抑制HIF-2α后能夠上調(diào)HIF-1α的蛋白，支持本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這種相互的調(diào)控以及由此產(chǎn)生的生存優(yōu)勢(shì)也許可以解釋僅敲除HIF-α的一個(gè)亞單位在目前腫瘤治療中存在困難的原因。因此，靶向攻擊HIF-1α和HIF-2α的治療應(yīng)該慎重考慮。

本組前期工作證明uPAR為小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物，且在干細(xì)胞高表達(dá)。本研究HIF-2α在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中亦呈高表達(dá)。設(shè)想HIF-2α和uPAR在小細(xì)胞肺癌組織的表達(dá)定位是否相關(guān)，免疫組化連續(xù)切片結(jié)果顯示HIF-2α與uPAR共同表達(dá)于小細(xì)胞肺癌壞死組織周圍區(qū)域。在膠質(zhì)瘤切片中HIF-2α與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物共表達(dá)[6]。HIF-2α與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物uPAR密切相關(guān)不是偶然事件，最近文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道HIF-2α能夠優(yōu)先表達(dá)于干細(xì)胞，并在干細(xì)胞維持中起到重要作用。鑒于小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中HIF-2α和uPAR表達(dá)均上調(diào)、小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α與uPAR共同表達(dá)于壞死組織周圍區(qū)域且缺氧能夠調(diào)節(jié)uPAR表達(dá)，作者推測(cè)HIF-2α可能作為uPAR的上游調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞通路中起著重要的作用。

缺氧微環(huán)境在腫瘤的生長(zhǎng)過程中起著重要的作用。隨著腫瘤體積的增加、氧濃度和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以維持腫瘤的生長(zhǎng)。因此，體積較大的腫瘤經(jīng)常會(huì)經(jīng)歷長(zhǎng)期的慢性缺氧。在應(yīng)對(duì)腫瘤的缺氧反應(yīng)時(shí)，HIF-1α和HIF-2α經(jīng)常起著不同的角色。在缺氧早期，HIF-1α急速增加，通過激活血管生成和糖代謝來調(diào)節(jié)對(duì)急性缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)。隨后形成一個(gè)中度缺氧微環(huán)境，該微環(huán)境能夠誘導(dǎo)HIF-1α迅速降解同時(shí)上調(diào)HIF-2α表達(dá)。當(dāng)HIF-2α積累到較高的水平時(shí)，通過激活其下游靶基因來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和生存優(yōu)勢(shì)。介導(dǎo)長(zhǎng)期的慢性缺氧反應(yīng)[5]。這可解釋隨著腫瘤體積增大，HIF-2α表達(dá)水平逐漸增加，如本組結(jié)果所示。大量數(shù)據(jù)表明，HIF-2α能夠特異的激活腎透明細(xì)胞癌中TGF-α和Cyclin D1的表達(dá)[19]。TGF-α和Cyclin D1均是細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。更重要的是，HIF-2α和HIF-1α相比，能夠通過增強(qiáng)c-myc的轉(zhuǎn)錄活力來促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。然而，HIF-1α卻抑制c-myc的轉(zhuǎn)錄活力[17]。根據(jù)以上的數(shù)據(jù)，作者推測(cè)HIF-2α在促進(jìn)小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)中起重要的作用。

缺氧能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移潛能[20-21]。本組結(jié)果顯示，HIF-1α與小細(xì)胞肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。然而，HIF-2α與小細(xì)胞肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。uPA/uPAR蛋白酶系統(tǒng)在缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[3]。本組結(jié)果表明HIF-2α與uPAR共同位于壞死組織周圍區(qū)域，推測(cè)HIF-2α-uPAR軸可能在缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。此外，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起著重要的作用。研究表明HIF-2α能夠促進(jìn)EMT的發(fā)生[22]。而且，在多種腫瘤細(xì)胞中Twist1已經(jīng)被確定為HIF-2α的下游靶基因[23]，其在調(diào)節(jié)EMT發(fā)生中也起著重要作用。有趣的是，uPAR也參與缺氧誘導(dǎo)的EMT的發(fā)生[24]。Jo等[25]指出腫瘤細(xì)胞高表達(dá)uPAR，可促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)變。因此，作者推測(cè)HIF-2α、uPAR和EMT可能在缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移過程中起著網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)。

綜上所述，HIF-2α在小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)且與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物uPAR表達(dá)呈正相關(guān)，提示HIF-2α表達(dá)可能與小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞樣特征有關(guān)；HIF-2α與小細(xì)胞肺癌患者增強(qiáng)的惡性腫瘤行為有關(guān)，這可能由其干細(xì)胞樣特征所決定。

[1] Semenza G L. Intratumoral hypoxia, radiation resistance, and HIF-1[J]. Cancer Cell, 2004,5(5):405-406.

[2] Chi J T, Wang Z, Nuyten D S,etal. Gene expression programs in response to hypoxia: cell type specificity and prognostic significance in human cancers[J]. PLoS Med, 2006,3(3):e47.

[3] Rofstad E K, Rasmussen H, Galappathi K,etal. Hypoxia promotes lymph node metastasis in human melanoma xenografts by up-regulating the urokinase-type plasminogen activator receptors[J]. Cancer Res, 2002,62(6):1847-1853.

[4] Harris A L. Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth[J]. Nat Rev Cancer, 2002,2(1):38-47.

[5] Holmquist-Mengelbier L, Fredlund E, Lofstedt T,etal. Recruitment of HIF-1 alpha and HIF-2 alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2 alpha promotes an aggressive phenotype[J]. Cancer Cell, 2006,10(5):413-423.

[6] Li Z, Bao S, Wu Q,etal. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells[J]. Cancer Cell, 2009,15(6):501-513.

[7] Covello K L, Kehler J, Yu H,etal. HIF-2alpha regulates Oct-4: effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth[J]. Genes Dev, 2006,20(5):557-570.

[8] Pietras A, Gisselsson D, Ora I,etal. High levels of HIF-2 alpha highlight an immature neural crest-like neuroblastoma cell cohort located in a perivascular niche[J]. J Pathol, 2008,214(4):482-488.

[9] Dontu G, Abdallah W M, Foley J M,etal. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells[J]. Genes Dev, 2003,17(10):1253-1270.

[10] Cicalese A, Bonizzi G, Pasi C E,etal. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells[J]. Cell, 2009,138(6):1083-1095.

[11] Qiu X F, Wang Z Y, Li Y L,etal. Characterization of sphere-forming cells with stem-like properties from the small cell lung cancer cell line H446[J]. Cancer Lett, 2012,323(2):161-170.

[12] Buchler P, Reber H A, Tomlinson J S,etal. Transcriptional regulation of urokinase-type plasminogen activator receptor by hypoxia-inducible factor 1 is crucial for invasion of pancreatic and liver cancer[J]. Neoplasia, 2009,11(2):196-206.

[13] Seidel S, Garvalov B K, Wirta V,etal. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha[J]. Brain, 2010,133(Pt 4):983-995.

[14] Basciano L, Nemos C, Foliguet B,etal. Long term culture of mesenchymal stem cells in hypoxia promotes a genetic program maintaining their undifferentiated and multipotent status[J]. BMC Cell Biol, 2011,12:12.

[15] Kim Y, Lin Q, Glazer P M,etal. Hypoxic tumor microenvironment and cancer cell differentiation[J]. Curr Mol Med, 2009,9(4):425-434.

[16] Heddleston J M, Li Z, McLendon R E,etal. The hypoxic microenvironment maintains glioblastoma stem cells and promotes reprogramming towards a cancer stem cell phenotype[J]. Cell Cycle, 2009,8(20):3274-3284.

[17] Gordan J D, Bertout J A, Hu C J,etal. HIF-2 alpha promotes hypoxic cell proliferation by enhancing c-Myc transcriptional activity[J]. Cancer Cell, 2007,11(4):335-347.

[18] Chambers I, Tomlinson S R. The transcriptional foundation of pluripotency[J]. Development, 2009,136(14):2311-2322.

[19] Raval R R, Lau K W, Tran M G,etal. Contrasting properties of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) and HIF-2 in von Hippel-Lindau-associated renal cell carcinoma[J]. Mol Cell Biol, 2005,25(13):5675-5686.

[20] 倪小晴, 張佐陽(yáng), 吳繼鋒. HIF-1α蛋白在胃癌中的表達(dá)及其與Wnt信號(hào)通路、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2014,30(2):140-144.

[21] 姜麗麗, 師永紅, 肖 瑞, 等. 乳腺癌細(xì)胞中HIF-1α對(duì)MMP1、8、15、16、17的調(diào)節(jié)作用[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2012,28(11):1188-1190.

[22] Kim W Y, Perera S, Zhou B,etal. HIF2 alpha cooperates with RAS to promote lung tumorigenesis in mice[J]. J Clin Invest, 2009,119(8):2160-2170.

[23] Gort E H, van Haaften G, Verlaan I,etal. The TWIST1 oncogene is a direct target of hypoxia-inducible factor-2 alpha[J]. Oncogene, 2008,27(11):1501-1510.

[24] Lester R D, Jo M, Montel V,etal. uPAR induces epithelial-mesenchymal transition in hypoxic breast cancer cells[J]. J Cell Biol, 2007,178(3):425-436.

[25] Jo M, Lester R D, Montel V,etal. Reversibility of epithelial-mesenchymal transition (EMT) induced in breast cancer cells by activation of urokinase receptor-dependent cell signaling[J]. J Biol Chem, 2009,284(34):22825-22833.

Expression of HIF-1α and HIF-2α in small cell lung cancerstem cells and tissues and their significance

LUAN Ya-jing, ZHENG Xu, QIU Xiao-fei

(TeachingCenterofBasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Purpose To observe the expression of HIF-1α and HIF-2α in tumor stem cells and tumor tissues of small cell lung cancer (SCLC) and to explore their clinical significance. Methods The defined serum-free culture was used to enrich the third passage tumor spheres cells from H446 as the tumor stem cells. Real-time PCR was performed to determine the mRNA expression level of HIF-1α and HIF-2α in H446 tumor stem cells. Immunofluorescence staining was performed to determine the protein expression level of HIF-1α and HIF-2α in H446 tumor stem cells. Immunohistochemistry SP method was used todetect the expression of HIF-1α and HIF-2α in SCLC tissues. Results The mRNA expression level of HIF-2α was up-regulated in tumor stem cells. However, the mRNA expression level of HIF-1α was down-regulated in tumor stem cells(P<0.05). The expression of HIF-2α protein was positive in tumor stem cells. In contrast, HIF-1α protein was negative in tumor stem cells. In SCLC tissues, the positive rate of HIF-1α was 46.7%(28/60), and the positive rate of HIF-2α was 25%(15/60). Correlation analysis showed that HIF-2α was positively correlated with SCLC stem cell marker uPAR, and they co-localized around necrotic regions. The expression of HIF-2α was closely related to tumor diameter and distant metastasis. In contrast, the expression of HIF-1α had no relationship with age, sexy, tumor size, lymph metastasis, pleural invasion and distant metastasis(P>0.05). Conclusion HIF-2α is up-regulated in SCLC stem cells and positively correlated with SCLC stem cell marker uPAR, which are associated with the tumor diameter and distant metastasis of SCLC patients, suggesting that the expression of HIF-2α may be related to SCLC stem-like characteristics.

lung neoplasms; small cell lung cancer; tumor stem cells; HIF-1α; HIF-2α

天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教學(xué)中心，天津 300070

欒雅靜，女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師。E-mail: yajingluan123@126.com 仇曉菲，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: qiuxf@tijtum.edu.com

時(shí)間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.009.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)08-0868-07

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.009

接受日期：2017-04-17