ARMS法檢測非小細胞肺癌液基細胞學標本中EGFR基因突變

萬 濤，余雪梅，胡前芳，徐 莉，劉金華，李岱容

ARMS法檢測非小細胞肺癌液基細胞學標本中EGFR基因突變

萬 濤1，余雪梅2，胡前芳1，徐 莉1，劉金華1，李岱容1

目的 探討非小細胞肺癌液基細胞學標本在突變擴增阻滯系統(amplification refractory mutation system, ARMS)檢測EGFR基因突變中的應用及特點。方法 收集診斷陽性的液基細胞學標本，提取樣本DNA，采用ARMS法檢測EGFR基因突變情況，并分析EGFR基因突變與臨床特征、標本類型、病理類型、腫瘤細胞含量等關系。結果 279例液基細胞學樣本中檢測EGFR基因突變117例，突變率為41.9%，其中腺癌突變率為44.7%，非腺癌突變率為15.4%；細胞學標本中腫瘤細胞含量豐富時、中等時、小的集群、少量時EGFR基因突變率分別為53%、44%、45%、24%；EGFR基因突變標本中，19外顯子缺失突變(19Del)發生比例為51.9%，21外顯子錯義突變L858R發生比例為39.4%。結論 各種類型的液基細胞學標本能夠很好的用于非小細胞肺癌EGFR基因突變檢測；腫瘤細胞含量豐富的樣本EGFR基因突變率高于腫瘤細胞含量較少的樣本。EGFR基因19Del最為常見。

肺腫瘤；非小細胞肺癌；液基細胞學；表皮生長因子受體基因突變；突變擴增阻滯系統

目前，超過70%的肺癌患者確診時已處Ⅳ期，無法手術，難以獲取腫瘤組織。因此他們的診斷大多數是通過針吸細胞學標本獲得。CT、超聲引導下的細針穿刺活檢、支氣管抽吸物、胸水及痰等細胞學檢查是晚期肺癌患者的主要診斷途徑，而液基細胞學正逐漸被廣泛用于此類標本的檢測[1-2]。隨著分子生物學技術的發展，肺癌靶向治療成為熱點，其中EGFR基因是肺癌分子檢測中最常用的分子靶點[3-4]。基于實時熒光定量PCR的突變擴增阻滯系統(amplification refractory mutation system, ARMS)是目前檢測EGFR基因突變最為敏感的方法。為探討液基細胞學標本在EGFR基因突變檢測中的應用及特點，本文采用ARMS法檢測胸腔積液、心包積液、纖維支氣管鏡抽吸物[5]、痰、細針穿刺針吸等通過微創方式獲取的細胞學標本中EGFR基因突變，并分析EGFR突變與肺癌患者臨床病理特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2014年2月～2015年7月行肺癌EGFR基因突變檢測的各類標本共計403例。液基細胞學標本為重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科細胞病理學室細胞學診斷為非小細胞肺癌后的剩余標本，細胞學標本要求液基細胞保存液中的剩余標本>10 mL以及液基薄層細胞涂片中癌細胞量不低于5%，共計279例，分別是胸腔積液97例、心包積液4例、纖維支氣管鏡抽吸物125例、痰液39例和淋巴結穿刺細胞學標本4例、超聲內鏡引導下的經支氣管針吸活檢(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration, EBUS-TBNA)細胞學標本10例。組織學標本來自于重慶醫科大學病理診斷中心，均為福爾馬林-石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)標本，共124例，其中包括手術切除標本21例、氣管鏡活檢標本88例、肺穿刺活檢標本15例。

1.2 液基細胞學處理及制片 胸腔積液或心包積液：標本經離心處理后，倒去上清液，滴加液基保存液稀釋細胞制成細胞懸液，如離心后下層含有較多的紅細胞，去掉上清液后，輕輕刮去表層細胞于另一離心管中，然后滴加液基稀釋細胞制成細胞懸液，沉降式制備薄片，剩余標本用于基因檢測。

痰液和纖維支氣管鏡抽吸標本檢查：將痰液和抽吸標本置于液基保存液中，加入黏液消化劑，震蕩15 min，2 000 r/min離心5 min，去掉上清液，然后滴加液基稀釋細胞制成細胞懸液，沉降式制備薄片，剩余標本用于基因檢測。

穿刺標本：將穿刺標本置于液基保存液中，2 000 r/min離心5 min，去掉上清液，然后滴加液基稀釋細胞制成細胞懸液，沉降式制備薄片，剩余標本用于基因檢測。

1.3 鏡下細胞學標本腫瘤細胞含量評估 雖然ARMS法檢測EGFR的靈敏度高，能夠檢測到標本中1%的腫瘤細胞，但細胞學標本中常含有較多的非腫瘤細胞，為了觀察腫瘤細胞在標本中的占比對EGFR狀態的影響，所有病例的涂片初步在光鏡下觀察液基薄層涂片中癌細胞數量占整個細胞量的比例，將其分為4級：(1)minimal：多數是紅細胞和有核細胞，腫瘤細胞群較少見；(2)small cluster：腫瘤細胞群不均勻的分布在整個片子上；(3)moderate：眾多的腫瘤細胞群廣泛分散在片子上；(4)abundant：大量細胞群分布在整個片子上。

1.4 標本中DNA的提取

1.4.1 液基細胞學標本DNA提取 收集液基細胞保存液中的細胞沉淀，按照QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Germany)試劑盒說明書提取標本中的DNA。用Nanodrop 2000分光光度計檢測DNA樣品的濃度。

1.4.2 石蠟標本處理及DNA提取 石蠟標本經病理學家評估腫瘤細胞含量≥10%，石蠟包埋組織5 μm厚連續切片8～10張，用于EGFR基因檢測。FFPE標本需經脫蠟及蛋白酶K消化處理，按照QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒說明書提取FFPE標本DNA。用Nanodrop 2000分光光度計檢測DNA樣品濃度。

1.5 EGFR基因突變檢測 本實驗室對各類標本提取基因組DNA并純化，采用ARMS PCR法對EGFR基因編碼區的4個外顯子29種突變位點進行檢測。根據人類EGFR基因21種突變檢測試劑盒(廈門艾德生物公司)說明書進行操作，并使用COBAS z480實時熒光定量PCR儀進行檢測。

1.6 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，不同標本類型、不同病理分型、不同分期、腫瘤細胞含量等組間EGFR基因突變率差異采用χ2檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鏡下液基細胞學的形態特征 液基細胞制片背景清晰，黏液雜質少。由于細胞固定及時，保存較好，立體感強。腺癌細胞呈單個、腺樣聚集，大圓形、多角形及柱狀，雙核或多核細胞常見，細胞質淡染透明，核/質比增大，核居中心或偏位，染色質呈細顆粒狀，有明顯核仁；也有呈乳頭狀或管狀腺樣排列或三五成群，群內細胞互相重疊形成立體三維結構，清晰、多層面，癌細胞凸現。液基涂片中鱗癌細胞體積大，有明顯異形性，核/質比例增大，核居中央，染色質呈粗顆粒狀，可見較大的核仁濃染、固縮；有的染色質呈團塊狀、胞質豐富粉染，高分化鱗癌細胞形態似蝌蚪形、纖維形或蛇形(圖1)。

2.2 樣本中DNA濃度的評價 所有樣本DNA提取后均經紫外分光光度計測量濃度及通過計算OD值進行質量評估，液基細胞學樣本DNA平均濃度為28.6 ng/μL(0.21～859.6 ng/μL)；石蠟包埋組織樣本DNA平均濃度為65.8 ng/μL(15.5～988.3 ng/μL)。2.3 臨床病理特征與EGFR基因突變的關系 本實驗共收集403例肺癌患者的臨床樣本，其中液基細胞學標本279例，組織學標本124例，通過ARMS法共檢測162例EGFR基因發生突變(陽性率為40.2%)，其中男性254例，女性149例；男性患者EGFR基因突變率為32.7%(83/254)，低于女性患者(53.0%，79/149)(P<0.000 1)。所有標本中診斷為腺癌者350例，鱗癌者47例，另有6例腺鱗癌。腺癌患者EGFR基因突變率為44.3%(155/350)，高于其他非小細胞肺癌者的EGFR基因突變率(13.2%，7/53)(P<0.01)。肺癌切除病例的EGFR突變率為33.3%(7/21)，肺部腫瘤小活檢病例的EGFR突變率為36.8%(38/103)，液基細胞學標本的EGFR突變率為41.9%(117/279)，臨床分期：Ⅰ～Ⅲa期者58例，Ⅲb～Ⅳ期者232例；分期不明者113例，Ⅰ～Ⅲa期與Ⅲb～Ⅳ期者EGFR基因突變率之間差異有統計學意義(20.7%vs42.7%，P<0.05，表1、2)。2.4 液基細胞學樣本與組織學樣本EGFR基因突變狀態的比較 為比較液基細胞學標本與組織學標本中EGFR基因突變率是否存在差異，本實驗對液基細胞學標本與組織學標本進行了分類統計(表2)。液基細胞學標本279例，腺癌的EGFR突變率為44.7%(113/253)，組織學標本124例，檢出腺癌者97例，EGFR突變率為43.3%(42/97)，液基細胞學與組織學標本兩組EGFR基因突變率之間差異無統計學意義(P>0.05)。

ABCDE圖1 腺癌細胞液基薄片鏡下所見，標本分別為痰液(A)、淋巴結穿刺(B)、胸水(C)和氣管鏡抽吸物(D)、胸水鱗癌(E)

2.5 不同組織類型EGFR基因突變狀態分析 403例非小細胞肺癌患者EGFR突變率為40.2%(162/403)，包括19外顯子(19Del)缺失突變84例(占總突變51.9%，84/162)，21外顯子置換突變(包括L858R和L816Q)66例(40.7%，66/162)，20外顯子插入突變(非敏感突變)2例(1.2%，2/162)、置換突變(G719X和T790M)10例(6.17%，10/162)。腺癌或鱗癌，EGFR基因突變類型主要為19Del和L858R突變(表3)。ARMS法檢測EGFR基因突變結果(圖2、3)。

表1 臨床病理特征與EGFR基因突變的關系

表2 液基細胞學樣本與組織學樣本中EGFR基因突變狀態的比較

表3 不同肺癌組織類型EGFR基因突變情況

圖2 ARMS法檢測19Del基因突變

圖3 ARMS法檢測L858R基因突變

2.6 不同類型細胞學標本的EGFR基因突變分析 本組實驗中診斷為腺癌的液基細胞學樣本共253例，其中針吸細胞學標本4例，EGFR基因突變率為50.0%(2/4)；積液標本101例，EGFR基因突變率為48.5%(49/101)；EBUS-TBNA樣本10例，EGFR基因突變率為30.0%(3/10)；纖維支氣管鏡抽吸物樣本99例，EGFR基因突變率為42.4%(42/99)，痰液標本39例，EGFR基因突變率為43.6%(17/39)。各組間EGFR基因突變率差異無統計學意義(P<0.05)。

表4 不同類型液基細胞學標本中腺癌EGFR基因突變發生率

2.7 標本中癌細胞量與EGFR基因突變之間的關系 為探討標本中癌細胞的量是否影響基因突變的檢出率，在光鏡下對243例腺癌標本的液基涂片中癌細胞數量占整個涂片細胞量的比例進行了評估、計數，根據細胞學標本中不同癌細胞量并分為4級(minimal、small cluster、moderate、abundant)，各級標本數量分別為minimal 29例，占比11.8%；small cluster 67例，占比27.5%；moderate 96例，占比39.6%；abundant 51例，占比21.1%(圖4A)。圖4B中可見癌細胞量較少時，EGFR基因突變率相對較低，樣本癌細胞量評價為minimal時EGFR陽性率僅為24%，當標本中癌細胞量評價為abundant時，其EGFR基因突變率為53%，兩者相比差異有統計學意義(P<0.05，)。當癌細胞量為moderate和small cluster時，AMRS法檢測EGFR基因突變率分別為44%和45%，與另外兩個級別相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖4 樣本中腫瘤細胞含量對EGFR突變檢出率的影響

A.不同癌細胞量的樣本數占總樣本數的百分比；B.癌細胞含量與EGFR基因突變率的關系；abundantvsminimal，*P<0.05

3 討論

因大多數晚期肺癌患者被診斷時已失去手術機會，故過去常采用以鉑類為基礎的聯合化療對患者進行治療。現在這些患者越來越多的選擇靶向治療，對肺腺癌患者的腫瘤樣本中進行基因突變分析，已成為一種常規的臨床實踐[6]。檢測EGFR活化突變在確定酪氨酸激酶抑制劑靶向療法的應用上起著至關重要的作用。預先了解肺腺癌患者的EGFR和K-RAS基因突變情況有利于臨床上合理選擇不同藥物對患者進行治療。

大部分肺癌患者通過細針穿刺細胞標本、胸腔積液、支氣管沖洗/刷和支氣管肺泡灌洗細胞學樣本等進行診斷[7]，細胞學標本有時候可能是分子檢測唯一可用的材料。但是在大多數細胞學標本中腫瘤細胞的數量是有限的，尋找一種更加敏感的檢測EGFR基因突變的方法顯得至關重要。有研究表明，直接測序檢測標本中腫瘤細胞<50%的突變DNA標本，重復性較差，很少能在<25%腫瘤細胞中檢測到突變。在眾多EGFR基因突變檢測方法中，直接測序法是DNA序列分析的“金標準”，但因只有突變DNA含量≥20%才能被檢測到，其敏感性并不高。由于非小細胞肺癌患者脫落細胞標本中常含有較多的正常細胞，為避免非腫瘤細胞對EGFR檢查結果的影響。故本組實驗采用ARMS法檢測EGFR基因突變，因敏感性高，可檢測含量低至1%的突變DNA，為真正的閉管無污染操作。

利用細胞學標本進行肺癌EGFR基因檢測已有報道，Billah等[8]收集263例肺癌患者的細胞學樣本，使用ARMS進行EGFR基因突變檢測，其細胞學樣本包括超聲引導下經氣管細針抽吸(endobronchial ultrasound-guided fine-needle aspiration, EBUS-FNA)、CT引導下FNA、胸水、心包積液以及肺泡、氣管灌洗液。結果顯示，總體標本不足率僅為6.2%。近年來EBUS-TBNA在臨床上對肺癌的診斷和分期的應用越來越廣泛，國內外不少學者也開始嘗試利用該細胞學標本提取DNA進行基因突變檢測。Garcia-Olive等[9]收集51例非小細胞肺癌患者的EBUS-TBNA細胞學標本，分析EGFR基因突變情況，標本經FFPE處理后，其中35例(68.6%)DNA提取的質量可以進行基因突變檢測。經FFPE的細胞塊在提取DNA時和經石蠟包埋的組織處理方法一樣，均需經過切片、二甲苯脫蠟、無水乙醇脫水、烘干等常規處理，在經過上述多種步驟、多種理化因素刺激及DNA酶的作用后，腫瘤細胞的DNA易于斷裂和降解，提取的DNA質量受到影響。本組實驗采用液基細胞學診斷后保存在液基細胞保存液小瓶內的標本，減少了DNA的降解，獲得較好的DNA提取滿意度。同時作者采用靈敏度更高的ARMS法進行EGFR基因突變檢測，可避免通過測序法進行檢測所導致的假陰性。

Hubers等[10]嘗試用靈敏度較高的技術檢測痰標本的EGFR基因突變情況，作者收集10例經組織學證實存在EGFR基因突變的肺癌患者痰液標本，分別釆用Cycleave PCR、COLD-PCR、PangaeaBiotech SL Technology和高分辨率溶解曲線分析技術(high resolution melting, HRM)等方法進行EGFR基因突變檢測，取決于檢測方法的不同，結果10例經組織學證實存在EGFR基因突變的痰標本成功檢測出了3～5例基因突變(30%～50%)。本組中共有35例痰標本，DNA濃度和純度均較滿意，雖然痰標本和纖維支氣管鏡抽吸物標本中均混有較多呼吸道分泌物及正常上皮細胞等干擾物，但是經過液基細胞技術處理后，不影響DNA提取的滿意率，說明痰標本是可以用于分子檢測的。

文獻報道[11]，EGFR突變率在東亞人群中為36.4%～66.3%，多見于非吸煙的女性腺癌患者，兩種主要的EGFR基因突變類型為19Del和L858R，19Del突變占45%～50%，L858R突變占45%～50%，其他少見突變(5%)主要為20外顯子置換和插入突變及18外顯子密碼子719置換突變。本組實驗結果發現腺癌患者EGFR突變率為44.3%(155/350)，19Del占總突變的52.3%(81/155)，L858R(包括L858R和L816Q)占總突變的39.4%(61/155)，20外顯子插入突變(非敏感突變)占1.3%(2/155)，總突變率與文獻報道一致，只是突變類型比例稍有不同，考慮與樣本量及人群選擇有關。本組中鱗癌的突變率為12.7%(6/47)，這與Choi等[12]研究發現亞裔鱗癌的突變率(11.1%，6/54)、非吸煙鱗癌突變率16.7%(2/12)等結果一致。未來將進行大樣本、非吸煙鱗癌患者的EGFR突變檢測及EGFR-TKIs療效隨訪實驗，以確定亞裔肺鱗癌患者尤其是非吸煙患者的EGFR突變率及EGFR-TKIs使用療效。

在有組織學標本的情況下，一般優先采用組織學標本進行EGFR基因和K-RAS基因檢測。Smouse等[13]曾按照滿意標本的標準即腫瘤細胞的數量大于有核細胞的25%，收集FFPE的細胞塊，提取DNA后對EGFR基因第18～24外顯子擴增，然后直接測序，得出的EGFR基因突變率高達58%(7/12)，因此指出細胞學標本中腫瘤細胞數量較少限制了其廣泛應用于測序，為盡量避免非腫瘤細胞的干擾，在進行EGFR基因突變檢測前對腫瘤組織/細胞量進行評估非常重要，否則會造成假陰性結果。與本組實驗相比，其EGFR基因的突變率較高，這可能是由于本組實驗采用了較多液基細胞學標本，其中有較多的病例腫瘤細胞含量較少，使得EGFR基因突變率降低。此外，Smouse等[13]選取的細胞學標本均是腺癌和支氣管肺泡癌病例，無鱗癌，而腺癌和支氣管肺泡癌的EGFR基因突變率比鱗癌高。因此，利用液基細胞學標本進行EGFR基因檢測前，需對樣本中腫瘤細胞含量進行評估，合適的樣本才能用于EGFR基因突變檢測。

總之，本組實驗表明液基細胞學標本是進行肺癌分子靶向治療基因檢測有價值的材料來源，對于很多肺癌晚期患者來說，通過獲取痰液、胸腹水、心包積液、纖維支氣管鏡抽吸物、細針穿刺針吸物等樣本進行細胞學診斷是常見的診斷方式。而這類標本目前廣泛采用液基細胞制片技術進行處理，由于液基細胞保存液能夠很好的保留細胞形態及其完整性，且不影響樣本核酸的提取，進行診斷后往往有多余標本，故將其用于肺癌EGFR基因檢測能夠避免患者再次取材或被迫接受有創性操作，提高標本的利用率，節省了時間及費用。本組實驗結果顯示與組織學標本相比，液基細胞學標本是一個很好的腫瘤細胞突變檢測來源。各種類型的液基細胞學樣本間EGFR基因突變率差異無顯著性，均可用于ARMS法檢測肺癌EGFR基因突變。特別是痰液標本也能夠用于肺癌EGFR基因突變檢測。在ARMS法檢測肺癌EGFR基因突變時，腫瘤細胞含量豐富的標本，EGFR基因突變率高于腫瘤細胞量較少的標本。因而在將細胞學標本送檢EGFR基因檢測之前，需對標本中腫瘤細胞含量進行評估，這樣才能保證檢測的真實、準確，避免出現假陰性。同時，本實驗通過液基細胞學樣本進行肺癌EGFR基因檢測還發現臨床分期Ⅲb～Ⅳ期的肺癌患者中，EGFR基因突變率高于臨床分期I～Ⅲa期的患者。當然這一結論尚需進一步深入分析。

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EGFR mutations detection in non-small cell lung cancerliquid based cytology samples by ARMS method

WAN Tao1, YU Xue-mei2, HU Qian-fang1, XU Li1, LIU Jin-hua1, LI Dai-rong1

(1DepartmentofRespiratoryDiseases,theFirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China；2DepartmentofClinicalLaboratory,University-TownHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China)

Purpose To explore the application and char-acteristics of liquid-based cytology samples of non-small cell lungcancer for detection of EGFR mutations by ARMS method. Methods The positive samples of liquid-based cytology were collected and the DNA of samples was extracted to detect the EGFR mutations by ARMS method and the analyze the association with clinical features, types of samples, pathological types and the contents of tumor cells, etc. Results There were 117 genetic mutations detected in 279 liquid-based cytology specimens, with the mutation rate of 41.9%. The mutation rate of adencarcinoma was 44.7% and the other was 11.3%. When the tumor cells in cytology samples were abundant, medium, small clusters and few, EGFR gene mutation rate were 53%, 44%, 45% and 44% respectively. 19Del was 51.9%. Exon 21 L858R missense mutation occurred at 39.4% of EGFR mutations. Conclusion All liquid-based cytology of non-small cell lung cancer samples are adequate for EGFR mutation analysis. In the tumor cell-rich samples EGFR gene mutation rate is higher than that of the less tumor cells samples. 19Del is the most common type of EGFR mutations.

lung neoplasms; non-small cell lung cancer; liquid based cytology; epidermal growth factor receptor gene mutation; amplification refractory mutation system

重慶市科委資助項目(cstc2016shmszx130029)

1重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科，重慶 4000162重慶醫科大學附屬大學城醫院檢驗科，重慶 401331

萬 濤，男，碩士，主管技師。E-mail: wantao715@sina.com 李岱容，女，博士，副主任技師，通訊作者。Tel: (023)89012745，E-mail: lidairong@126.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.012.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)08-0884-07

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.012

接受日期：2017-04-07