食管胃結(jié)合部腺癌中CHK1蛋白的表達(dá)及意義

閆靜波，衛(wèi) 茹

·短篇論著·

食管胃結(jié)合部腺癌中CHK1蛋白的表達(dá)及意義

閆靜波1，衛(wèi) 茹2

目的 探討CHK1蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌中的表達(dá)及臨床意義。方法 采用免疫組化和Western blot法檢測(cè)141例正常胃黏膜、112例胃黏膜上皮內(nèi)瘤變及141例食管胃結(jié)合部腺癌中CHK1蛋白的表達(dá)，并分析其與食管胃結(jié)合部腺癌臨床病理征特的關(guān)系。結(jié)果 從正常胃黏膜組→低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組→高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組→食管胃結(jié)合部腺癌組，免疫組化及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示CHK1蛋白表達(dá)分別為9.22%、22.73%、48.53%、79.43%及1、2.40±0.11、5.39±0.37、9.01±1.52，CHK1蛋白表達(dá)逐漸上升(P<0.05)。在食管胃結(jié)合部腺癌中，CHK1蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌病理分化程度及Lauren分型相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 CHK1蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

食管腫瘤；食管胃結(jié)合部腺癌；上皮內(nèi)瘤變；CHK1；Western blot

細(xì)胞周期紊亂可引起基因組的不穩(wěn)定，這與腫瘤的關(guān)系密切[1]。細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase 1, CHK1)是細(xì)胞檢驗(yàn)點(diǎn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，CHK1在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、抗腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤耐藥性等方面密切相關(guān)[2]。CHK1能對(duì)放療化療所導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，CHK1高表達(dá)容易造成腫瘤對(duì)放、化療耐藥[3]。目前CHK1已成為腫瘤研究的潛在靶點(diǎn)之一。近年來食管胃結(jié)合部腺癌發(fā)病率明顯上升，腫瘤中心位于胃食管交界(esophagogastric junction, EGJ)及上下各5 cm范圍內(nèi)的腺癌即為食管胃結(jié)合部腺癌，食管胃結(jié)合部腺癌最常用的分型是Siewert分型：SiewertⅠ型，腫瘤中心位于EGJ上1～5 cm處，即下段食管癌；SiewertⅡ型，腫瘤中心位于EGJ上1 cm至下2 cm范圍，即賁門癌；SiewertⅢ型，腫瘤位于EGJ下2～5 cm范圍，即賁門下癌[4]。Siewert三種類型，Ⅱ、Ⅲ型相對(duì)較多見，Ⅰ型相對(duì)較少見[5]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法和Western blot法檢測(cè)CHK1蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌標(biāo)本的表達(dá)，對(duì)CHK1蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌的作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2005年～2015年10年內(nèi)河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科存檔的食管胃結(jié)合部腺癌標(biāo)本141例，并且經(jīng)過一位病理副主任醫(yī)師診斷，一位病理主任醫(yī)師審核。

1.2 研究分組 食管胃結(jié)合部腺癌組141例，胃黏膜上皮內(nèi)瘤變組112例，正常胃黏膜組141例。各組情況如下：食管胃結(jié)合部腺癌組標(biāo)本共141例，術(shù)前均無放、化療：患者男性93例，女性48例；年齡<50歲者56例，≥50歲者85例；腫瘤最大直徑<4 cm 78例，≥4 cm 63例；組織學(xué)分化：高分化50例，中+低分化91例；Lauren分型：腸型85例，彌漫型56例；癌組織侵犯黏膜層或黏膜下層(早期胃癌)32例，侵及肌層或漿膜層(中晚期胃癌)109例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者81例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者60例；SiewertⅠ型6例，SiewertⅡ型71例，SiewertⅢ型64例。胃黏膜上皮內(nèi)瘤變組112例，其中低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變44例，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變68例。正常胃黏膜組141例，取自胃癌標(biāo)本距腫物5 cm遠(yuǎn)的胃黏膜。以上三大組標(biāo)本，均分為兩份：一份經(jīng)10%中性福爾馬林固定，以備HE和免疫組化染色；另一份放入液氮凍存，以備Western blot檢測(cè)。

1.3 免疫組化 采用免疫組化EnVision兩步法進(jìn)行CHK1染色。CHK1蛋白在胞質(zhì)和胞核表達(dá)。(1)按著色強(qiáng)度評(píng)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：≥2分為(+)，0～1分為(-)。

1.4 Western blot檢測(cè) 對(duì)各研究組的蛋白進(jìn)行提取，參照蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蛋白的含量，做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠內(nèi)的樣品蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%BSA常溫振蕩封閉1 h。一抗(CHK1抗體)4 ℃過夜，二抗室溫1 h。然后加入堿性磷酸酶顯色劑顯色20 min。用掃描儀掃描NC膜上蛋白表達(dá)條帶灰度，用自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，正常胃黏膜組的平均光密度值(OD值)取值為1，其它各組與正常胃黏膜組相比取值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，先做總的χ2檢驗(yàn)，然后進(jìn)行兩兩χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kaplan-Meier分析CHK1蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌生存期的關(guān)系。采用Log-rank單因素分析臨床病理特征與食管胃結(jié)合部腺癌生存期的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)CHK1的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示：從正常胃黏膜組→低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組→高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組→食管胃結(jié)合部腺癌組，CHK1蛋白表達(dá)逐漸上升(P<0.05，表1，圖1)。

表1 免疫組化法檢測(cè)正常胃黏膜組、上皮內(nèi)瘤變組、 食管胃結(jié)合部腺癌組中CHK1的表達(dá)

2.2 Western blot法檢測(cè)CHK1的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示：從正常胃黏膜組→低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組→高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組→食管胃結(jié)合部腺癌組，CHK1蛋白表達(dá)逐漸上升(表2，圖2)。

表2 Western blot法檢測(cè)正常胃黏膜組、上皮內(nèi)瘤變組、 食管胃結(jié)合部腺癌組中CHK1的表達(dá)

圖2 Western blot法檢測(cè)CHK1蛋白表達(dá)

1.正常胃黏膜組；2.低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組；3.高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組；4.食管胃結(jié)合部腺癌組

2.3 CHK1表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌臨床病理特征的關(guān)系 統(tǒng)計(jì)分析顯示，CHK1表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌病理分化程度及Lauren分型相關(guān)(P<0.05)，CHK1蛋白在中+低分化胃腺癌的表達(dá)強(qiáng)于高分化胃腺癌；Lauren分型中，CHK1蛋白在彌漫型胃腺癌中的表達(dá)強(qiáng)于腸型胃腺癌(表3)。

表3 CHK1表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理參數(shù)nCHK1陽(yáng)性陰性陽(yáng)性率(%)χ2值P值性別 男93712276．341．5950．207 女4841785．42年齡(歲) <5056461082．140．4180．518 ≥5085661977．65腫瘤直徑(cm) <478631580．770．1910．662 ≥463491477．78分化程度 高50341668．006．1980．013 中+低91781385．71Lauren分型 腸型85612471．767．7020．006 彌漫型5651591．07侵犯深度 早期3224875．000．4980．480 中晚109882180．73淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無81602174．073．3460．067 有6052886．67Siewert分型 Ⅰ65183．33 Ⅱ71561578．870．0140．907 Ⅲ64511379．69

3 討論

近年胃竇癌發(fā)病率逐年下降；相反，食管胃結(jié)合部癌的發(fā)病率持續(xù)上升，食管胃結(jié)合部腺癌的進(jìn)展較快，預(yù)后較差，約80%的食管胃結(jié)合部腺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)晚期，其5年生存率常低于30%[6]。與胃竇癌相比，食管胃結(jié)合部腺癌較早深層胃壁浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[7-8]。食管胃結(jié)合部腺癌最常用的分型為Siewer分型，SiewertⅢ型預(yù)后最差，SiewertⅡ型次之，SiewertⅠ型預(yù)后最好。在西方國(guó)家，這三型的發(fā)病率基本相同；在我國(guó)，SiewertⅠ少見，而SiewertⅡ和Ⅲ多見。肖文光等[9]的研究結(jié)果顯示，我國(guó)SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分別占3.9%、53.1%、43.0%；楊宏等[10]的研究結(jié)果顯示，我國(guó)SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分別占4.7%、50.3%、45.0%。本組141例食管胃結(jié)合部腺癌中SiewertⅠ、Ⅱ、Ⅲ型分別為6例、71例、64例，所占比例分別為4.3%、50.3%、45.4%，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

ABC

圖1 CHK1在正常胃黏膜組(A)、上皮內(nèi)瘤變組(B)和食管胃結(jié)合部腺癌組(C)中的表達(dá)，EnVision兩步法

調(diào)控細(xì)胞周期是一個(gè)復(fù)雜的過程，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和其蛋白控制著細(xì)胞周期，細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)蛋白質(zhì)缺失會(huì)引起細(xì)胞周期的紊亂，其紊亂造成基因組不穩(wěn)定，這與腫瘤關(guān)系密切[1]。研究細(xì)胞周期的調(diào)控能夠?yàn)樘剿髂[瘤發(fā)生、發(fā)展和腫瘤放、化療的耐藥性提供思路。CHK1是一種細(xì)胞檢驗(yàn)點(diǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，多數(shù)研究結(jié)果顯示在多種腫瘤細(xì)胞中CHK1高表達(dá)，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥性等方面發(fā)揮作用[2]，CHK1異常表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)對(duì)DNA損傷失去修復(fù)作用，增加機(jī)體腫瘤易感性，引起腫瘤發(fā)生。目前，CHK1已成為腫瘤耐藥性研究的潛在靶點(diǎn)之一，因?yàn)镃HK1能夠修復(fù)放療化療引起的瘤細(xì)胞DNA損傷，CHK1其表達(dá)水平不但與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，而且與放、化療的效果關(guān)系密切，CHK1高表達(dá)容易造成腫瘤對(duì)放、化療耐藥[3]。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，從正常胃黏膜組→低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組→高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組→食管胃結(jié)合部腺癌組，CHK1蛋白表達(dá)逐漸上升(P<0.05)。結(jié)果顯示，從正常胃黏膜→低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變→高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變→高分化腺癌→低分化腺癌，CHK1蛋白表達(dá)逐漸上升，結(jié)果說明CHK1蛋白可能在食管胃結(jié)合部黏膜的癌變及其發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

分析CHK1蛋白與食管胃結(jié)合部腺癌臨床病理因素的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CHK1表達(dá)與患者年齡、性別、侵犯深度、腫瘤大小、Siewert分型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)；然而，CHK1蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌的病理分化程度和Lauren分型相關(guān)(P<0.05)。CHK1蛋白在中+低分化胃腺癌的表達(dá)強(qiáng)于高分化胃腺癌；Lauren分型中，CHK1蛋白在彌漫型胃腺癌的表達(dá)強(qiáng)于腸型胃腺癌；這說明CHK1可能與食管胃結(jié)合部腺癌的惡性程度及發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)系，其可能是判斷腫瘤惡性程度高低及分級(jí)的重要標(biāo)志。隨著腫瘤的進(jìn)展，惡性程度的增高，CHK1蛋白表達(dá)升高，提示CHK1蛋白可能促進(jìn)食管胃結(jié)合部腺癌的發(fā)生、發(fā)展。Lauren分型彌漫型胃腺癌CHK1蛋白表達(dá)高于腸型胃腺癌，彌漫型胃腺癌主要包括低分化腺癌及印戒細(xì)胞癌，惡性程度相對(duì)較高，預(yù)后較差，而腸型胃腺癌主要指高分化腺癌，惡性程度相對(duì)較低，預(yù)后較好，仍然提示CHK1蛋白在低分化食管胃結(jié)合部腺癌中表達(dá)高，CHK1蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，如果患者CHK1蛋白升高，那么預(yù)后較差。

本組實(shí)驗(yàn)中CHK1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，CHK1蛋白可能促進(jìn)食管胃結(jié)合部腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后較差，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

目前，CHK1已成為腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)。放、化療能夠造成腫瘤細(xì)胞DNA的損傷，CHK1蛋白能夠?qū)@種DNA損傷進(jìn)行修復(fù)。腫瘤細(xì)胞能夠利用活化的G2/M期檢測(cè)點(diǎn)，延長(zhǎng)此期的阻滯，使受損的DNA進(jìn)行修復(fù)，這樣就會(huì)引起腫瘤對(duì)放化療耐藥[11]。如果腫瘤細(xì)胞內(nèi)CHK1蛋白升高，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和電離輻射敏感的敏感性降低，腫瘤治療效果欠佳[12]。因此，采用RNA干擾技術(shù)，抑制CHK1的表達(dá)，消除放化療引起DNA損傷后誘導(dǎo)的G2期阻滯，抑制G2/M期的檢測(cè)點(diǎn)，會(huì)增加腫瘤細(xì)胞凋亡，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物和放射線的敏感性，消除腫瘤細(xì)胞的耐藥性[3]。

綜上所述，從正常胃黏膜→低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變→高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變→高分化腺癌→低分化腺癌，CHK1蛋白表達(dá)逐漸上升。CHK1蛋白表達(dá)與食管胃結(jié)合部腺癌的病理分化程度、Lauren分型有關(guān)，作者推測(cè)CHK1蛋白促進(jìn)食管胃結(jié)合部腺癌的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后。深入研究CHK1蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌的表達(dá)及其機(jī)制，會(huì)給治療食管胃結(jié)合部腺癌尋找新的有效途徑。

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邢臺(tái)市市級(jí)科技計(jì)劃自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(2017ZC119)

1河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺(tái)市人民醫(yī)院病理科，邢臺(tái) 0540012邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校微免教研室，邢臺(tái) 054000

閆靜波，男，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail: yanjingbo2012@163.com

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