荷人卵巢癌小鼠異種移植模型的建立及其生物學特性

李若玢，陳均源， 歐陽媛，高綠芬，王曉玉

荷人卵巢癌小鼠異種移植模型的建立及其生物學特性

李若玢，陳均源， 歐陽媛，高綠芬，王曉玉

卵巢腫瘤；Matrigel；NOD/SCID小鼠；裸鼠；動物模型

卵巢癌病死率位居婦科三大惡性腫瘤之首，病理同型癌癥患者的基因層面差異導致其對傳統放、化療敏感性各異[1]。患者源性異種移植(patient-derived xenograft, PDX)小鼠模型中除了癌細胞以外，還包括人體免疫、纖維、脈管細胞等間質成分，與傳統細胞株懸液構建的小鼠模型相比，保留了原腫瘤部分免疫生長微環境，為卵巢癌耐藥機制研究、新藥開發及治療方案篩選提供了具有預測價值的個性化抗癌藥物療效檢測平臺[2]。然而目前PDX建模方法存在成瘤率低、周期長、成本高、難以擴大規模等不足，本實驗針對其不足進行改進，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 人卵巢癌原代及傳代異種移植模型建立 BALB c(nu-nu)雌性裸小鼠58只，NOD/SCID雌性小鼠6只，鼠齡4～8周，購自北京華阜康生物公司，合格證號：SCXK(京)2014-0004，飼養于暨南大學實驗動物中心無特定病原體環境下。術中取患者新鮮卵巢癌組織(病理診斷為卵巢黏液性囊腺癌高分化型)置于4 ℃ RPMI 1640培養液(美國Gibco公司)，于凈化工作臺上去除微小血管及壞死組織，無菌生理鹽水反復沖洗后剪切成大小2 mm×2 mm×2 mm組織塊，冰浴下1 ∶1與Matrigel(美國BD公司)混合備用。小鼠常規消毒，取備用組織塊于套管針頭內，組織鑷提起右背部表皮，于皮膚張力最大處穿刺進入小鼠右腋下，推動實體針，植入皮下，標本離體后須在1 h內完成接種，此為原代荷人卵巢癌小鼠模型(下稱PDX1)，其中NOD/SCID小鼠6只(下稱PDX1-1)，裸小鼠8只(下稱PDX1-2)。待初種瘤體直徑達1 cm后，選擇表面血供好、無破潰，質地稍硬荷瘤小鼠處死，取瘤體外圍發亮部分組織，按上述移植方法接種于25只裸小鼠，建立第2代荷人卵巢癌小鼠模型(下稱PDX2)。再次成瘤后重復上述步驟，建立第3代荷人卵巢癌小鼠模型(下稱PDX3)。

1.2 移植后動物及瘤體生長情況觀察 每日進行小鼠全身狀況、活動情況觀察及瘤體測量，按公式V=(D×d2)/2計算瘤體體積(D為腫瘤表面最長徑，d為腫瘤表面最短徑)，繪制瘤體生長變化曲線。處死小鼠后肉眼觀察移植瘤的形態、質地、活動度、播散范圍及轉移情況。瘤體組織固定于10%中性福爾馬林中，石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，采用t檢驗，計量資料采用或百分率表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人卵巢癌移植瘤生長情況 各代卵巢癌小鼠成瘤率分別是PDX1-1 83%(5/6)、PDX1-2 0(0/8)、PDX2 100%(25/25)、PDX3 100%(25/25)。根據瘤體生長情況繪制生長變化曲線圖(圖1)，提示瘤體于5～6周左右進入指數生長期，8周左右基本成瘤。原代NOD/SCID小鼠較裸小鼠成瘤率高，生長速度更快，并伴發頭面部、腹腔臟器轉移灶(圖2A)；傳代裸小鼠成瘤及生長速度更快，但均無轉移情況(圖2B)；以上瘤體直徑接近1.5 cm即出現表面破潰、壞死，直徑超過3 cm荷瘤鼠出現行動不便、食欲減退、消瘦等惡病質表現。

圖1 實體瘤生長曲線

2.2 移植瘤大體形態 切除的瘤體外觀呈球形，質稍硬，包膜多完整，表面可見血管紋理，剖開后呈乳白色，囊實性，部分瘤體內含黏液，較大瘤體中央可見液化性壞死區(圖3)。

2.3 人卵巢癌及其各代模型瘤組織鏡檢 PDX1移植瘤鏡下可見腺腔樣結構，腺體大小不一，形態不規則，間質較少，上皮細胞明顯異型性，核仁明顯，病理性核分裂象易見，與人卵巢癌原有排列結構及瘤細胞的異型性特征基本一致。隨著傳代次數增加，分化變低，腺樣結構逐漸消失，上皮細胞分化差，核異型性明顯(圖4)。

②A②B③④A④B④C④D

圖2 荷卵巢癌小鼠：A.NOD/SCID小鼠；B.裸小鼠 圖3 實體瘤大體形態 圖4 人卵巢癌及其各代模型瘤組織HE染色：A.人卵巢癌；B.PDX1-1；C.PDX2；D.PDX3

3 討論

建立PDX模型首先要解決宿主抗人組織的免疫排斥問題，國外常用T、B、NK三系免疫細胞缺陷的NOD/SCID小鼠建模，成瘤率高，建模周期短，但成本昂貴[3]。國內多采用T細胞功能缺陷的裸小鼠建模，雖然大大降低了成本，但成瘤率及瘤體生長速率明顯降低[4]。Mullen等[5]采用Matrigel與5種卵巢癌細胞株混合后移植到小鼠體內，成瘤率可提高至90%以上。Matrigel是從EHS小鼠肉瘤中提取的細胞外基質蛋白，富含各種促進細胞增殖及分化的生長因子及蛋白，4 ℃呈液態，與新鮮組織混合后注入小鼠皮下，于皮溫下逐漸凝固，包裹移植組織，形成一個各項因子濃度梯度分布穩定，具有一定免疫隔離作用的腫瘤生長微環境[6]。

李艷等[7]選取64例上皮性卵巢癌組織于裸小鼠體內接種，原代成瘤率分別為：漿液性腺癌52.5%、子宮內膜樣腺癌62.5%、透明細胞腺癌71.43%、低分化腺癌60%、黏液性腺癌0，裸鼠間傳代成功率達94.12%。本實驗接種組織為黏液性腺癌，接種結果表明，裸小鼠體內難成瘤的人卵巢癌細胞，能夠在NOD/SCID小鼠體內成瘤，且瘤體生長速度及轉移率均增高，深度免疫功能缺陷小鼠，能夠為腫瘤細胞提供一個更為優良的生長環境。同時，Matrigel能夠在一定程度上促進腫瘤細胞生長。原代移植瘤PDX1傳代于裸小鼠后，PDX2及PDX3成瘤率均接近100%，分析其可能原因為人卵巢癌組織移植小鼠后，癌細胞進入重新適應小鼠組織內環境的過程，其中分化較低、侵襲性較高的腫瘤細胞得以保留并繼續克隆，每次傳代相當于一次篩選，惡性程度逐漸增高，同時部分間質細胞被小鼠間質細胞替代，異種免疫原性降低，腫瘤細胞生長微環境逐漸趨向穩定，成瘤率也隨之增高。

Scott等[8]認為，初發患者手術標本建立的PDX模型能夠很好地模擬復發后卵巢癌的發生、發展過程，并可先于臨床復發進行治療方案篩選，為復發患者的有效治療搶得先機，然而目前PDX的建模時間需要至少4～8個月[9]。本實驗對PDX建模方法進行改進，結合Matrigel的使用，根據NOD/SCID小鼠及裸小鼠的優缺點，首先在NOD/SCID小鼠皮下建立數只原代種鼠模型，后采用裸小鼠進行穩定傳代迅速擴大荷瘤小鼠規模，建立了一種成瘤率高、成本低、觀察周期較長、傳代穩定易復制的小鼠荷瘤模型。不過，本實驗也存在以下不足：(1)標本來源于臨床手術患者，對于非手術患者無法建模，今后應在實驗中嘗試采用臨床穿刺活檢組織或腹腔積液細胞進行移植建模。(2)由于免疫缺陷鼠的使用，導致該模型無法預知免疫功能對腫瘤的殺傷作用，不適用于生物免疫治療相關研究。(3)瘤體僅傳至第3代，模型例數較少，同時缺乏人源腫瘤間質細胞相關檢測，不足以充分觀察傳代后移植瘤生長及微環境變化情況，還需進一步深入完善。

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暨南大學附屬第一醫院婦科，廣州 510600

李若玢，女，碩士，醫師。E-mail: 373602649@qq.com 王曉玉，女，教授，博士生導師，主任醫師，通訊作者。 E-mail: wxyjnu@icloud.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.024.html

R 737.31

B

1001-7399(2017)08-0925-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.024

接受日期：2017-04-20