不同固定時間和烤片時間對乳腺浸潤性導管癌HER-2、p16免疫組化染色的影響

陳志強，王 瑩，米賢軍，鐘守軍，陳 昂，鄧文同

不同固定時間和烤片時間對乳腺浸潤性導管癌HER-2、p16免疫組化染色的影響

陳志強，王 瑩，米賢軍，鐘守軍，陳 昂，鄧文同

乳腺腫瘤；免疫組織化學；HER-2蛋白；p16蛋白

免疫組化是應用抗原與抗體特異性結合的原理，為腫瘤的鑒定、來源、分型及發現微小轉移灶的研究提供重要的分析診斷方法[1]。免疫組化操作步驟繁瑣、操作過程影響因素較易誤診。一方面，由于組織固定不當引起的。固定不當可引起組織結構發生自溶和定位不確[2]。另一方面，烤片時間也常常影響免疫組化染色效果[3]。本實驗擬通過比較86例乳腺浸潤性導管癌組織在不同固定及烤片時間下進行HER-2、p16蛋白免疫組化染色的差異，為乳腺浸潤性導管癌組織HER-2、p16蛋白免疫組化染色標準化提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 SAKURA Tissue Tek Vip-5全自動密閉式組織脫水機為日本櫻花檢驗儀器株式會社生產，Thermo HM325輪轉石蠟切片機為德國Thermo生產，DHG-9140A電熱恒溫干燥箱由上海精宏公司生產，BenchMark XT自動免疫組化染色機由美國Ventana公司生產。HER-2抗體、p16抗體及免疫組化檢測試劑盒均購自美國Ventana MedicalSystems公司。

1.1.2 研究對象 收集中山市博愛醫院2015年8月～2016年10月存檔的臨床病理資料完整的原發性乳腺癌86例。患者均為女性，年齡27～78歲，平均53.8歲。術前均未行任何輔助治療(內分泌治療、放療、化療)，病理診斷均為乳腺浸潤性導管癌。各標本均見明顯的腫瘤，組織按照標準取材大小(0.5 cm×0.3 cm×0.2 cm)切取。

1.2 方法

1.2.1 標本制備 標本經10%中性緩沖福爾馬林中分別固定2、5、10、15、24 h后進入常規石蠟切片程序，裱片于防脫載玻片上，放置于75 ℃溫箱烤片，分別烤10、15、30、60、120 min。

1.2.2 免疫組化 烘干的切片在Bench Mark XT自動免疫組化染色機進行染色，中性樹膠封固。每次染色均以PBS代替一抗作陰性對照，用已知乳腺浸潤性導管癌HER-2、p16蛋白陽性標本作陽性對照。

1.2.3 結果判斷與評分 HER-2蛋白染色結果的評定參考《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》標準[4]：0和1+為陰性，2+為不確定，3+為陽性。p16蛋白依據陽性細胞率計算：陽性細胞數<1%為(-)，1%～10%為(1+)，11%～50%為(2+)，>50%為(3+)。每張組織切片的免疫組化染色均在相同的實驗條件下進行，以保證結果的客觀性和可靠性。

2 結果

2.1 不同固定時間的HER-2、p16蛋白染色結果 75 ℃烤箱中烤片30 min，HER-2蛋白固定時間為15 h，樣品的陽性率為24.42%，顯著高于固定時間為2、5、10、24 h的各處理組(P<0.05)；p16蛋白固定時間為15 h，樣品的陽性率為48.84%，顯著高于固定時間為2、5、10、24 h的各處理組(P<0.05，表1)。

表1 不同固定時間標本HER-2、p16蛋白免疫組化染色結果

與固定時間15 h組相比，aP<0.05

2.2 不同烤片時間處理標本的HER-2、p16蛋白染色結果 組織固定時間為15 h，在75 ℃烤箱中烤片30 min，HER-2蛋白陽性率為25.58%，顯著高于10、15、60、120 min的各處理組(P<0.05)；p16蛋白的陽性率為46.51%，顯著高于10、15、60、120 min的各處理組(P<0.05，表2)。

表2 不同烤片時間處理標本HER-2、p16蛋白染色結果

與烤片時間30 min組相比，aP<0.05

3 討論

HER-2蛋白是相對分子質量為18.5×104的跨膜蛋白，是乳腺癌患者重要的治療及預后指標，可指導靶向藥物的選擇、判斷預后[5]。p16蛋白是相對分子質量為1.6×104的蛋白，細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)抑制因子，該基因結構或功能上的缺失導致細胞異常生長，導致人類惡性腫瘤的發生[6]。免疫組化是檢測HER-2、p16蛋白最常用的方法，組織固定、烤片是免疫組化檢測過程中的重要環節。免疫組化操作過程步驟較多、不穩定性因素增加、檢測結果易受諸多因素的影響，但最主要的影響因素是組織前期處理中的固定、烤片環節，它們也是影響實驗室間檢測結果準確性和可重復性的主要因素[7]。

本實驗對HER-2、p16蛋白的固定時間進行了實驗探索。結果表明，用10%中性緩沖福爾馬林固定乳腺癌浸潤性導管癌標本15 h，75 ℃烤箱中烤片30 min，HER-2蛋白陽性率為24.42%，與Rakha等[8]研究證實在20%～30%的原發性浸潤性乳腺癌中有HER-2蛋白的過表達相符。用10%中性福爾馬林固定乳腺癌浸潤性導管癌標本15 h，75 ℃烤箱中烤片30 min，p16蛋白得到了最佳免疫染色效果，與聶艷紅等[6]報道結果基本相符。

綜上所述，以HER-2、p16蛋白為目標抗原研究乳腺浸潤性導管癌免疫組化染色效果，如何選擇固定與烤片時間，歸根到底是選擇使組織內抗原的保存及暴露恰到好處、獲得最佳染色效果的時間。

[1] 陳 艷, 潘美華. 全自動免疫組化儀與手工操作應用體會[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(6):708.

[2] 吳 菡, 孫蘇安. 乙醇固定時間在細胞蠟塊技術中的應用[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(1):99-100.

[3] 錢金林, 王登山, 李林秋, 等. 烤片方法對不同組織類型切片皺褶產生的影響[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2016,32(11):1301-1303.

[4] 《乳腺癌HER2檢測指南(2014版)》編寫組.乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)[J]. 中華病理學雜志, 2014,43(4):262-267.

[5] Lv Q, Meng Z, Yu Y,etal. Molecular mechanisms and translational therapies for human epidermal Receptor 2 positive breast cancer[J]. Int J Mol Sci, 2016,17(12):e2095.

[6] 聶艷紅, 劉 慧, 周衛寧, 等. 不同亞型乳腺癌中 p16 基因啟動子甲基化[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2012,28(11):1202-1205.

[7] 步 宏, 楊文濤. 以標準化的乳腺癌HER2檢測帶動病理診斷質量的提高[J]. 中華病理學雜志, 2014,43(4):217-218.

[8] Rakha E A, Starczynski J, Lee A H,etal. The updated ASCO/CAP guideline recommendations for HER2 testing in the management of invasive breast cancer: a criticalreview of their implications for routine practice[J]. Histopathology, 2014,64(5):609-615.

廣東省醫學科學技術研究基金(A2017321)、廣東省中山市衛生和計劃生育局醫學科研立項課題(2014J128)

南方醫科大學附屬中山博愛醫院病理科，中山 528400

陳志強，男，副主任技師。E-mail: 765228687@qq.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.025.html

R 392.3

B

1001-7399(2017)08-0927-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.025

接受日期：2017-03-02