UroVysion熒光原位雜交技術在尿路上皮癌細胞學檢測中常見問題分析

林興滔，葛 巖，許 潔，王慧玲，駱新蘭

UroVysion熒光原位雜交技術在尿路上皮癌細胞學檢測中常見問題分析

林興滔1，葛 巖1，許 潔1，王慧玲2，駱新蘭1

尿路上皮癌；熒光原位雜交；尿液；脫落細胞

尿路上皮癌是泌尿系統最為常見的惡性腫瘤[1]。近年來，尿路上皮癌的發病率呈逐年上升趨勢，且易復發。尿細胞學檢查及膀胱鏡/輸尿管鏡檢是診斷尿路上皮癌的常見手段。前者對低級別尿路上皮癌的敏感性偏低，且易受結石、炎癥等因素的影響而出現假陽性結果；后者則為有創檢查，費用昂貴且不易識別微小腫瘤[2-3]。遺傳學研究表明尿路上皮癌易發生染色體畸變和染色體數目異常。其中3和17號染色體的多體性、7號染色體的三體性、9p21基因的雜合性缺失與尿路上皮癌的發生及復發顯著相關[4]。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是通過用熒光標記的單鏈核苷酸探針，按堿基互補原則和細胞核內與之同源的DNA靶序列結合，在熒光顯微鏡下觀察是否有染色體變異的技術，具有快速、簡便、結果穩定、可重復性好、敏感性高、特異性強等優點，是當前輔助診斷眾多腫瘤的重要方法[5-6]。目前，UroVysion FISH法已通過美國FDA批準上市用于臨床檢測尿液脫落細胞，是診斷尿路上皮腫瘤及評估復發的重要方法，在全國已廣泛開展。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2008～2015年廣東省人民醫院存檔的500例尿液脫落細胞學FISH樣本。

1.2 試劑和儀器 美國Path Vysis公司UroVysion Bladder Cancer Recurrence Kit探針試劑盒，日本Olympus公司(型號BX51)熒光顯微鏡，美國ThermoBrite公司雜交儀(型號S50024)，水浴鍋，電磁爐，溫度計，無水乙醇。

1.3 方法 收集至少200 mL尿液標本(晨尿最佳)置于離心管中，1 500 r/min離心10 min。去上清，加入5 mL預熱至37 ℃的0.075 mol/L KCl溶液，吹打懸浮細胞，37 ℃水浴溫育30 min，期間吹打2～3次。于細胞低滲混合液中緩慢加入2 mL固定液，混勻，1 500 r/min離心10 min。去上清，加入5 mL固定液，混勻，靜置10 min。離心去上清，根據細胞量加適量固定液，制成濃度適宜的細胞懸液，混勻后滴片。用吸管將細胞懸液吹打混勻后吸取少量，滴至干凈的載玻片上，自然晾干。室溫下于2×SSC溶液中漂洗玻片2次，每次5 min。將玻片置于37 ℃胃蛋白酶工作液中浸泡5 min。于2×SSC溶液中漂洗玻片2次，每次5 min。然后將玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脫水，自然干燥。10 μL探針滴加于標本區域，切片封固后放入雜交儀75 ℃變性5 min，37 ℃雜交孵育過夜，去封片膠，放入2×SSC中泡掉蓋玻片，置于72 ℃ 0.3%NP40/2×SSC洗2 min，自然晾干。加上DAPI于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 判讀標準 在100倍鏡下觀察膀胱上皮脫落細胞的FISH結果并進行信號計數。正常細胞為2個紅色信號，2個綠色信號，2個藍色信號，2個金色信號(圖1)。根據廠家提供的判讀標準進行判讀，標準如下：計數25個細胞，若出現以下兩種情況，則為陽性：(1)若有4個以上細胞同時出現2個或者更多染色體擴增的情況(3、7或17)(圖2)；(2)≥12個細胞內存在9p21缺失，則為陽性。如果一直為陰性，則應全片計數，直至出現4個以上細胞同時出現2個或者更多染色體擴增的情況(3、7或17)或≥12個細胞內9p21缺失，則可判讀為陽性。若計數全片后，仍無上述結果，則為陰性。

①②

圖1 UroVysion FISH陰性結果 圖2 UroVysion FISH陽性結果

2 結果

500例尿液脫落細胞學FISH樣本中有12例樣本因細胞數量過少而無法判讀，剩余有效病例為488例，陽性率為13.32%，陰性率為86.68%。

3 討論

3.1 尿液標本DAPI染色一般情況分析 制片完成后，消化時應用DAPI染色由醫師來判讀，一方面了解細胞消化狀態，一方面對細胞數量、組成成分、細胞分布及細胞形態有初步了解。如所觀察的細胞學樣本中尿路上皮細胞的數量如何、炎癥細胞數量多少、是否存在細菌，如若存在炎癥細胞，則應明確主要細胞成分是中性粒細胞、淋巴細胞還是單核細胞；尿樣中細胞核比小淋巴細胞核大1.5～2倍，呈橢圓形或圓形的多為尿路上皮細胞核。同時還應注意尿路上皮細胞是散在分布還是成團分布；尿路上皮細胞形態是正常，還是具有異型性。上述觀察對于后期FISH觀察有重要的指導作用。3.2 FISH信號的一般判斷 細胞學FISH觀察順序同組織學的FISH觀察方法，首先在40倍鏡下初步了解是否含有細菌、細胞分布是否均一、是否有局部成團的細胞，了解所觀察玻片的一般情況后可轉至100倍鏡下進行下一步觀察。

3.3 細胞數量的控制 細胞數量可影響觀察的準確度。可適當控制所需進行FISH染色的滴片細胞數量，細胞數量過多或過少均會影響觀察的準確度，特別是尿路上皮細胞數量過少，則需要重新收集尿液，否則容易漏診[7]。對于多次采樣細胞量均不足的樣本，建議患者排尿前應用振動按摩器在下腹壁恥骨聯合上方按摩膀胱20 min后留尿，或取灌洗液，可大大提高送檢標本中尿路上皮細胞的數量。作者應用12孔的玻片，將3、10、30 μL梯度細胞懸液分別滴于第1、2、3孔，從而保證細胞數量。

3.4 混有其他細胞的處理 根據混有細胞種類的不同，處理方式不同：(1)若為女性患者，在樣本收集過程中混入陰道分泌物，從而尿液細胞中可能混入子宮頸細胞。此種情況，在HE染色情況下可以區別，如混入細胞數量不多，則不會對結果造成影響；如混入細胞數量較多，在熒光顯微鏡下難以區分。且如果無法確定尿路上皮細胞來源將影響最終結果，有必要建議臨床再次取材送檢。(2)若為男性患者，則有可能混入精液，其內的精子在HE玻片中易于辨別：通常細胞形態較小，一端稍尖，另一端帶有鞭毛。在熒光顯微鏡下，這些基本形態依稀可辨，所以對最終結果無影響。(3)含大量白細胞的尿液，此種情況下，炎癥細胞數量占多數，而尿路上皮細胞數量少。一般而言，如為急性感染，則尿液中主要的炎癥細胞為中性粒細胞，細胞核多呈分葉狀，此種情況易與尿路上皮細胞相辨別。如果為慢性感染，則主要炎癥細胞為淋巴細胞和漿細胞，因經過FISH消化、洗滌處理后，炎細胞腫脹不易與尿路上皮細胞相鑒別，此種情況下，FISH檢測容易出現假陰性結果。處理方法：如混入的淋巴細胞數量較少，同時尿路上皮細胞數量相對較多且在DAPI通道下難以區分時，一般可在白光下根據細胞胞質的量來確定，淋巴細胞胞質少，而尿路上皮細胞胞質較多，借此加以區分。如混入的淋巴細胞數量較多，同時尿路上皮細胞也較少且在DAPI通道下難以區分時，一般建議經臨床積極抗炎治療后，復查尿液脫落細胞FISH結果。一般經過抗炎之后，尿液中白細胞數量明顯減少，而尿路上皮細胞數相對增加，此時FISH結果均有較高的可信性及可重復性。在臨床工作中，部分患者經抗炎治療后，復查FISH結果，FISH為陰性者，多為復雜尿路感染，如尿路結石，而FISH結果陽性者多為尿路上皮腫瘤所致的尿路感染，兩者在臨床上均可表現為肉眼血尿。

3.5 結果判讀 細胞重疊、破損、未去除細胞質的細胞核不計數，微弱雜交信號不計數，細胞內雜交信號互相靠近者計為1個信號。一般來說，如果陽性細胞數很高或很低，判讀均無疑。但是對剛好處于閾值的病例而言，則很難判讀陰陽性，此時，應由另外一名醫師進行重復計數。

FISH用于尿路上皮癌的診斷具有特異性高、敏感性強的特點，但是由于收集的細胞來源于晨尿中的脫落細胞，細胞來源有一定的隨機性，因而有一定的漏診情況發生，故應對臨床強調對于FISH檢測的患者最好連送3次樣本以減低漏診的可能。其次，在分子報告中，如果結果為陰性，一般要求觀察計數全片的尿路上皮細胞，如在此過程中，觀察計數不仔細或方法不得當，仍有一部分漏診可能發生。如何有效的觀察計數，以更大限度的控制漏診的可能則是分子病理醫師在日常工作中迫切需要解決的問題。

總之，尿液脫落上皮細胞FISH檢測是診斷尿路上皮癌或術后復查的重要方法，而準確的判讀則為該方法的有效性提供了保證。然而，目前針對尿液脫落上皮細胞的FISH檢測尚未有規范化的操作程序或標準化的結果判讀，而病理醫師在日常工作中也經常會遇到復雜的情況。因此，作者總結了近幾年來UroVysion FISH檢測中遇到的常見問題供大家參考和討論，旨在進一步提高FISH在尿液脫落細胞中檢測的可重復性和準確性，以提高其在尿路上皮癌中的早期診斷率及協助術后復發診斷率。

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廣東省醫學科學技術研究項目(A2016284)、廣東省醫學科學技術研究項目(A2015048)、廣東省中醫藥局科研項目(20161006)

1廣東省人民醫院(廣東省醫學科學院)病理醫學部病理科，廣州 5100802廣東省人民醫院廣東省醫學科學院普通外科，廣州 510080

林興滔，男，主管技師。E-mail: lingxingtao@126.com 駱新蘭，女，主任技師，通訊作者。E-mail: lanx_luo@126.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.028.html

R 737

B

1001-7399(2017)08-0933-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.028

接受日期：2017-03-29