FISH檢測子宮頸石蠟組織切片與液基薄層細胞中hTERC基因的比較

潘曉婷，吳 秀，張哲珺，甘丹卉，蔣光愉

FISH檢測子宮頸石蠟組織切片與液基薄層細胞中hTERC基因的比較

潘曉婷，吳 秀，張哲珺，甘丹卉，蔣光愉

hTERC基因；FISH；石蠟包埋組織；蛋白酶K；液基薄層細胞；胃酶

子宮頸癌是女性生殖系統中最常見的腫瘤之一，近幾年子宮頸癌的發病率呈逐年上升且發病年齡日趨年輕化[1]。在臨床工作中對子宮頸癌及癌前病變的篩查要求越來越高。目前各大醫院相繼開展FISH技術檢測子宮頸hTERC基因檢測應用。同時已有很多子宮頸液基細胞涂片FISH技術檢測的相關報道。而子宮頸石蠟包埋切片FISH技術檢查子宮頸hTERC基因在臨床應用比較少。本文針對子宮頸石蠟包埋組織切片和液基薄層細胞學(thinprep cytologic test, TCT)標本用FISH技術檢查子宮頸hTERC基因實驗操作進行比較觀察。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集來自暨南大學附屬第一醫院病理科診斷為子宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelical neoplasia, IN)1～3的子宮頸石蠟包埋組織50例和TCT標本63例。分成兩組進行實驗，分別為石蠟組織樣本組和TCT樣本組。

1.2 主要試劑 胃蛋白酶，蛋白酶K，探針GLP TERC CSP3(探針由北京金菩嘉醫療公司提供)，2×SSC，乙醇。

1.3 主要儀器 OlympusBX51正置熒光顯微鏡，Dake原位雜交儀，德國耶拿CCD攝像頭，俄羅斯VIDEOTEST熒光原位雜交圖像分析軟件，電熱恒溫水箱。

1.4 方法 石蠟組織樣本組FISH實驗操作過程：(1)樣本玻片制備：常規甲醛固定石蠟組織，3 μm厚切片，用硅膠涂膠玻片，65 ℃烤片2～3 h。這一處理使高溫變性玻片上組織的DNA不致掉片。(2)切片脫蠟：二甲苯5 min×3次，100%、95%、80%、70%梯度乙醇復水，去離子水沖洗。(3)酶消化：預處理微波用H檔5 min煮沸蒸餾水，再轉至ML檔將切片放置水中20 min。2×SSC漂洗5 min×2次。37 ℃蛋白酶K消化5～6 min，室溫下用2×SSC漂洗5 min×2次，乙醇梯度脫水固定，自然干燥。(4)變性、雜交：由金菩嘉公司提供的探針，在避光環境中配置探針混合液，將混合液滴于雜交區域，封片。放置Dake原位雜交儀，83 ℃ 5 min變性，42 ℃ 16 h雜交。(5)洗滌：在溫度46 ℃下玻片置于2×SSC 5 min，1%NP-40 3 min，室溫下70%乙醇3 min。玻片自然干燥后加DAPI復染液，放置數分鐘后即可OlympusBX51正置熒光顯微鏡下觀察。

TCT樣本組FISH實驗操作過程：(1)樣本玻片制備：取TCT檢查剩液約10 mL，1 200g離心10 min，1×PBS洗滌2遍后離心去除上清液；膠原酶B 5 mL(1 mg/mL)37 ℃水浴30 min，再次離心。加入5 mL去離子水，低滲重新吹打懸浮細胞。37 ℃水浴30 min，加2 mL固定液(甲醇 ∶冰乙酸=3 ∶1)預固定5 min。離心后棄上清液，再加5 mL固定液重復以上“固定、去除上清液的”步驟2次，用沉淀的細胞制備成一定濃度的溶液，將細胞滴于玻璃上，放置56 ℃ 烤片3 h老化細胞片。(2)酶消化：37 ℃胃蛋白酶消化30 s～20 min，室溫下用2×SSC 5 min、2次漂洗，乙醇梯度脫水固定，自然干燥。(3)變性雜交：由金菩嘉公司提供的探針，在避光環境中配置探針混合液，將混合液滴于雜交區域，封片。放置Dake原位雜交儀，75 ℃ 5 min變性，42 ℃ 16 h雜交。(4)洗滌：在溫度46 ℃下玻片置于2×SSC 5 min，1% NP-40 3 min，室溫下70%乙醇3 min。玻片自然干燥后加DAPI復染液，放置數分鐘后即可OlympusBX51正置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 結果判定 (1)信號判斷：用OLYMPUS BX51熒光顯微鏡DAPI/FITC/TRITC三單通濾光鏡觀察計數，采用Imstar-FISH 3.0軟件進行圖像采集及處理。選擇熒光信號清晰細胞核形態完整的間期細胞進行計數，每例至少分析100個細胞，統計異常細胞比例。記錄紅色(hTERC)信號數和綠色(CSP3)信號數，正常細胞紅色信號和綠色信號各為2個，異常細胞為紅色信號≥3個，綠色信號≥2個細胞。(2)閾值建立：選用20例正常子宮頸脫落細胞進行FISH檢測，每例至少分析100個細胞統計異常細胞比例。計算閾值=平均數(M)+3×標準差(SD)，通過計算本次實驗采用有效陽性閾值=4.95%[2]。

1.6 結果判斷 每例樣本隨機計數至少100個細胞，如果異常細胞比例大于陽性閾值則判斷有hTERC基因擴增(FISH陽性，圖1、2)，如果異常細胞比例<4.95%則判斷無hTERC基因擴增(FISH陰性，圖3、4)。

①②③④

圖1 石蠟組織樣本組：hTERC陽性，FISH檢測顯示異常細胞紅色(hTERC)信號≥3個和綠色(CSP3)信號≥2個 圖2 液基薄層細胞樣本組：hTERC陽性，FISH檢測顯示異常細胞紅色(hTERC)信號≥3個和綠色(CSP3)信號≥2個 圖3 石蠟組織樣本組：hTERC陰性，FISH檢測顯示正常細胞紅色(hTERC)信號和綠色(CSP3)信號各為2個 圖4 液基薄層細胞樣本組：hTERC陰性，FISH檢測顯示正常細胞紅色(hTERC)信號和綠色(CSP3)信號各為2個

2 結果

將石蠟組織樣本組和TCT樣本組在酶消化時間、背景干凈度、細胞數量滿意度、熒光信號滿意度、熒光信號雜交成功率等兩組數據相比，石蠟組織樣本組消化時間比較恒定，時間短，易掌控。而TCT樣本組酶消化時間有長有短，難掌控。因為細胞受液基薄層細胞保存液固定和細胞在樣本制備過程中低滲處理細胞膨脹程度不同的影響。石蠟組織切片在處理后背景干凈度、細胞數量滿意度、熒光信號滿意度以及雜交成功率均較子宮頸脫落細胞制片高(表1)。

表1 石蠟組織切片與液基薄層細胞FISH實驗結果對比

3 討論

FISH是一種分子細胞遺傳學技術，通過熒光標記的DNA探針與細胞核內的DNA靶序列雜交，在熒光顯微鏡下對細胞和(或)組織原位觀察并分析細胞和內雜交于DNA靶序列的多種彩色探針信號，以獲得細胞內多條染色體(或染色體片段)或多種基因狀態的信號。FISH技術近幾年廣泛用于臨床醫學檢測，在檢測染色體數量和結構的畸變上非常有效。

FISH技術用于石蠟包埋組織檢測hTERC基因優點：細胞數量足夠多，而且組織結構清晰、集中，酶消化時間易掌控，處理后玻片背景干凈度，細胞數量滿意度，細胞形態，熒光信號滿意度以及雜交成功率均較子宮頸脫落細胞制片高，石蠟包埋組織檢測可在選片部位正確的基礎上避免血液、黏液的干擾[3]。

在臨床工作中，各級醫院病理醫師的制片、閱片水平存在一定差異，從而導致病理診斷結果存在一定主觀偏倚，而且有時CIN相鄰兩級之間很難區分。而FISH檢測石蠟組織切片，組織結構完整清楚，子宮頸細胞易辨認，而且對于CIN在相鄰兩級之間難以分級時通過FISH檢測可以選擇相應區域的細胞閱片計數。因此用FISH技術檢查子宮頸組織hTERC基因可提高CIN病理分級的準確性，對于臨床CIN的治療和隨訪有著更深厚的意義。

FISH技術用于子宮頸細胞懸液樣本檢測hTERC基因擴增成功關鍵：(1)制備細胞片時，要注意包括樣本黏液、血液、炎細胞、細菌、雜質、細胞在玻片分布均勻等方面的處理。子宮頸細胞懸液樣本檢測hTERC基因存在很多外在因素影響。例如上皮細胞量、血液、炎細胞、黏液、細菌、雜質等均會影響雜交信號以及結果判讀。而且子宮頸脫落細胞易受生理周期及外界因素所影響，不同年齡婦女以及月經周期中的不同時間子宮頸上皮厚薄以及脫落細胞的成分均有不同的變化，可能會影響到檢測的熒光信號及結果。因此每例患者的標本均不一樣，對于整個實驗檢測影響就會存在不同的差異。(2)樣本玻片預處理過程中胃蛋白酶消化時間的控制很重要，觀察玻片制備后標本類型來控制玻片消化時間。標本的類型包括有裸核的標本和無裸核的標本，有裸核的標本細胞形態根據全裸核和部分裸核來調節消化時間，無裸核的標本根據細胞質厚薄，細胞核的大小來確定消化時間。(3)雜交熒光信號的觀察讀片：注意炎細胞和子宮頸細胞辨別，避開重疊細胞區，選擇細胞分布均勻的平坦區來計數。

FISH技術用于石蠟包埋組織檢測hTERC基因有兩方面的問題要注意：(1)切片本身的因素，即最初組織的處理，固定情況，石蠟包埋的過程以及樣本的年限、切片厚度等。因為組織類型、切片厚度、固定時間等均會使得理想的消化時間發生改變[4]。(2)石蠟包埋切片的處理因素，包括雜交前的酶消化、雜交后的洗滌等。因為雜交前的酶消化是FISH檢測的關鍵步驟[5]，雜交后的洗滌溫度和pH值對熒光信號強弱有密切關聯。只要保持這兩方面的實驗室條件穩定，整個實驗檢測穩定性就很好，差異不大。在上前述因素中最關鍵最難把握就是酶消化環節，因此把握好雜交前酶消化處理環節，是獲取良好信號的前提。在石蠟包埋切片FISH技術中，因為組織標本之間的個體差異和每個實驗室制片過程的差異，因此建議在不同的實驗室甚至不同批次的樣本中在進行FISH技術雜交檢測前，首先要對酶的消化時間進行調整。

本組實驗存在不足，樣本例數少，如果有更大樣本量支持，結果將更有科學依據和臨床意義。

[1] Jemal A, Siegel R, Xu J,etal. Caneerstatisties,2010[J]. CA Caneer J Clin, 2010,60(5):277-300.

[2] 蔣光愉, 甘丹卉, 潘曉婷. hTERC基因檢測在宮頸上皮內瘤變差異化治療的應用[J].暨南大學學報, 2012,33(4):382-386.

[3] 伍軍平, 王建六, 羅 新. 如何利用TERC基因做好宮頸癌篩查分流及隨訪工作[J]. 中國計劃生育和婦產科, 2016,8(10):7-11.

[4] 陳 慧, 陳 淳, 王 華, 等. 利用相差顯微鏡觀察FISH檢測石蠟包埋切片的理想消化程度[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2013,29(7):809-810.

[5] 陳順平. FISH中酶消化細胞的幾點體會[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2010,26(1):116.

廣東省廣州市暨南大學附屬第一醫院病理科 510630

潘曉婷，女，技師。E-mail: panxiaoting5701@126.com 蔣光愉，女，主任醫師，通訊作者。Tel: (020)38688436，E-mail: jianggy1107@163.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.030.html

R 394.2； R 737.33

B

1001-7399(2017)08-0937-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.030

接受日期：2017-04-14