β-catenin在食管癌侵襲轉移過程中的作用

秦燕子，王曉麗，劉明俊，王樂樂，單利娜，李卓然，陶儀聲

β-catenin在食管癌侵襲轉移過程中的作用

秦燕子1，王曉麗2，劉明俊3，王樂樂3，單利娜3，李卓然3，陶儀聲1

目的 探討β-catenin在食管癌侵襲轉移過程中的作用。方法 轉染有效的β-catenin基因siRNA干擾片段于食管癌Eca-109細胞中，下調β-catenin表達：CCK-8增殖實驗檢測沉默該基因對食管癌細胞增殖能力的影響；Transwell小室實驗檢測對其侵襲、遷移能力的影響；Western blot法檢測β-catenin表達下調后WISP2、TCF4及E-cadherin蛋白表達。結果 CCK-8增殖實驗結果顯示，干擾組(siRNA干擾片段有效轉染的下調β-catenin組)細胞增殖能力明顯低于空白對照組(未處理組)及陰性對照組(轉染無意義片段組)(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。Transwell小室實驗結果顯示，干擾組遷移、侵襲能力均低于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)。Western blot結果顯示，WISP2、E-cadherin蛋白在干擾組中的表達量高于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)；TCF4蛋白在干擾組中的表達量低于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)。結論 在食管癌細胞中，下調β-catenin后，Wnt信號通路的相關因子也出現明顯改變，推測沉默食管癌中Wnt信號通路β-catenin因子，E-cadherin表達增加，抑制上皮-間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)，阻礙食管癌細胞增殖，通過減少TCF4表達，促進下游靶基因WISP2表達，從而抑制腫瘤細胞侵襲、轉移；β-catenin基因有望成為靶向治療食管癌的候選基因。

食管腫瘤；侵襲；轉移；增殖；β-catenin

食管癌的發生嚴重威脅著人類健康，其復發和轉移很難得到有效控制。研究證明，食管癌的增殖、侵襲和轉移是多基因參與的多步驟復雜過程[1-2]。Wnt信號通路的異常激活在食管癌的發生、發展過程中起到一定的作用。β-catenin在細胞內的異常聚集是此信號通路異常激活的標志性體現。Wnt-1信號蛋白與細胞膜上的受體蛋白Frizled結合后，引起細胞內游離的β-catenin過度集聚，而后β-catenin進入細胞核內與轉錄因子相互作用，調節下游基因轉錄，影響細胞增殖、分化等行為[3]。研究證實β-catenin在食管癌中高表達，本次實驗通過下調β-catenin表達，探究其對食管癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系 人食管癌細胞系Eca-109購自上海復祥生物公司細胞庫。

1.2 主要試劑、抗體 DMSO、Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑購自美國Invitrogen公司，質粒提取試劑盒、反轉錄試劑盒，蛋白試劑盒、β-catenin引物(上游序列5′-ATGGACAGTATGCAATGACTCG-3′，下游序列5′-TAGCAGACACCATCTGAGGAGA-3′，357 bp)及β-actin引物(上游序列5′-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3′，下游序列5′-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3′，317 bp)購自武漢谷歌生物公司，β-catenin siRNA干擾片段(有義鏈5′-GGAUGUGGAUACCUCCCAATT-3′，反義鏈5′-UUGG GAGGUAUCCACAUCCTT-3′)、β-catenin siRNA陰性對照片段(有義鏈5′-GGAUGUGGAUACCUCCCAAT T-3′，反義鏈5′-UUGGGAGGUAUCCACAUCCTT-3′)由上海吉瑪生物公司設計，β-catenin抗體(鼠抗人)、E-cadherin抗體(兔抗人)、TCF4抗體(鼠抗人)購自美國Affbiotech公司，WISP2抗體(兔抗人)購自美國Abcam公司。

1.3 方法 細胞轉染：復蘇細胞，更換培養液，細胞轉染，將Lipofectamine 2000和β-catenin siRNA按照6 ∶4比例稀釋于500 μL的不含抗生素的opti-MEM培養液中，放置在超凈臺上，避光孵育20 min，接種到六孔板內，收集細胞。Western blot實驗：提取細胞蛋白，測定蛋白濃度并制備檢測樣品，電泳，轉膜，封抗，一抗濃度β-catenin(1 ∶2 000)、WISP2(1 ∶1 000)、TCF4(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶5 000)、β-catin(1 ∶10 000)，化學發光、顯影。qRT-PCR凝膠圖像分析：提取Total RNA，按照實驗說明操作，反應體系20 uL，40個循環(50 ℃ cDNA 15 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)。Transwell侵襲實驗：每孔隨機選取8個視野進行觀察拍照，計算平均穿過基膜的細胞數。細胞遷移實驗：小室內不需要鋪Matril基質膠，步驟、結果處理同侵襲實驗。CCK-8增殖實驗：終止細胞培養，移除培養液，加入新鮮培養基，每孔加入10 μL CCK-8試劑(保持總體積每孔100 uL)，置于CO2培養箱4 h，450 nm濾光片下測OD值。各組實驗均重復3次。

2 結果

2.1 Western blot法檢測β-catenin蛋白表達 本實驗在細胞水平通過Lipofectamine 2000和β-catenin siRNA形成的復合物成功瞬時轉染Eca-109細胞株，干擾β-catenin表達后，應用Western blot法測得β-catenin與β-actin灰度值比值，空白對照組、陰性對照組、干擾組分別為1.749±0.012、1.735±0.004、0，分析得出β-catenin蛋白表達量在干擾組中顯著低于空白對照組、陰性對照組(P<0.05，圖1)。

圖1 各實驗細胞β-catenin和β-actin蛋白的表達 A.空白對照組；B.陰性對照組；C.干擾組

2.2 qRT-PCR檢測各組食管癌細胞中β-catenin mRNA的表達 siRNA沉默β-catenin后，提取各組細胞的總RNA，應用核酸蛋白分析儀測定總RNA濃度，得出各組細胞中β-catenin mRNA的相對表達量，結果顯示空白對照組、陰性對照組、干擾組中的β-catenin mRNA的相對表達量分別為1.542±0.046、1.377±0.046、0.292±0.05。干擾組與其它兩組相比，β-catenin mRNA的相對表達水平顯著下調(P<0.05，圖2)，而陰性對照組與空白對照組之間差異無顯著性(P>0.05)。

圖2 各實驗組細胞β-catenin基因的擴增曲線: A.空白對照組；B.陰性對照組；C.干擾組

2.3 沉默β-catenin對各組食管癌細胞侵襲能力的影響 倒置顯微鏡下計數穿過Matrigel基質膠的細胞數，反應細胞侵襲能力，結果顯示空白對照組、陰性對照組、干擾組穿透Matrigel基質膠的細胞數分別為129.67±8.50、124.67±11.01、47.33±4.16。干擾組細胞數顯著低于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)，而與空白對照組、陰性對照組之間差異無顯著性(P>0.05，圖3)。

2.4 沉默β-catenin對各組食管癌細胞遷移能力的影響 倒置顯微鏡下計數穿過微孔濾膜的細胞數，反應細胞遷移能力，結果顯示空白對照組、陰性對照組、干擾組穿透聚碳酸微孔濾膜的細胞數分別為95.5±4.69、102.1±4.33、47.8±5.21。干擾組細胞數顯著低于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)，而與空白對照組、陰性對照組之間差異無顯著性(P>0.05，圖4)。

2.5 CCK-8增殖實驗 種板24、48、72、96 h后在酶標儀下分別測定OD值，實驗重復3次以上，得不同時間點各實驗組數據(表1)，統計分析得出，干擾組的增殖能力顯著低于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)。

2.6 下調β-catenin后WISP2、E-cadherin、TCF4蛋白的表達 提取各實驗組蛋白，應用Western blot法檢測各實驗組因子與β-actin灰度值比值，在空白對照組、陰性對照組、干擾組中：WISP2分別為0.12±0.02、0.38±0.01、0.53±0.02；E-cadherin分別為0.123±0.015、0.19±0.06、0.53±0.02；TCF4分別為0.643±0.035、0.74±0.04、0.16±0.03。SPSS 20.0統計軟件分析：干擾組的WISP2、E-cadherin蛋白表達量均高于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組之間差異無顯著性(P>0.05)；干擾組的TCF4蛋白表達量低于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)，而空白對照組及陰性對照組之間差異無顯著性(P>0.05，圖5)。

③A③B③C④A④B④C

圖3 Transwell細胞侵襲試驗中穿過Matrigel基質膠的細胞：A.空白對照組；B.陰性對照組；C.干擾組 圖4 Transwell細胞遷移試驗中穿過基膜的細胞：A.空白對照組；B.陰性對照組；C.干擾組

表1 各實驗組在不同時間點的OD值

圖5 WISP2、E-cadherin、TCF4與β-actin在各實驗組中的表達 A. 空白對照組；B.陰性對照組；C.干擾組

3 討論

侵襲、遷移能力作為惡性腫瘤的重要生物學行為是目前熱點研究領域，以此可以探索腫瘤的發生、發展機制。隨著對連環蛋白與惡性腫瘤關系認識的加深，細胞黏附分子與惡性腫瘤生物學行為的關系被推向新的階段[4]。β-catenin具有介導細胞黏附及參與Wnt信號傳導的雙重功能[5]，是Wnt信號通路的關鍵調控因子，在多種腫瘤細胞如黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌等中高表達[6]，參與腫瘤發生、發展多個環節[7]。本實驗利用siRNA干擾技術，合成靶向沉默β-catenin的雙鏈siRNA[8]干擾片段，qRT-PCR和Western blot實驗證明在食管癌細胞株中轉染siRNA載體后，β-catenin mRNA和蛋白表達被顯著抑制；Transwell小室及CCK-8實驗發現，干擾組細胞的增殖、遷移及侵襲能力均低于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組之間差異無顯著性(P>0.05)。本次實驗提示，在食管癌中有效沉默β-catenin因子可以抑制食管癌細胞的增殖、侵襲及轉移，β-catenin可能作為食管癌分子生物治療的新候選基因。

WISP2是生長因子CNN家族成員之一，其在促進細胞增殖、介導細胞黏附、參與細胞遷移及腫瘤形成等方面發揮作用[9]。本課題組前期實驗證明在食管癌中WISP2低表達，并且與β-catenin存在相關性，提示WISP2可能作為一種保護因子抑制其發生、發展[10]。本組實驗利用siRNA干擾技術，在食管癌細胞Eca-109中沉默β-catenin因子，發現WISP2在干擾組中蛋白表達量明顯高于空白組和陰性對照組(P<0.05)，與前期研究結果相吻和[10]。有研究顯示，WISP2與Wnt信號通路有關，WISP2被證實為Wnt-1信號通路的下游靶基因[11]。在乳腺癌細胞株中敲除WISP2基因可以誘導上皮-間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)[12]發生，從而促進癌細胞侵襲和遷移[13]。Haque等[14]發現在三陰型乳腺癌中WISP2能夠激活誘導并促進細胞停滯在G0/G1期，降低細胞增殖。推測可能在食管癌細胞中Wnt信號通路異常激活后，通過沉默β-catenin而作用于該信號通路的其它因子，促使下游靶基因WISP2的表達，進而抑制Eca-109細胞的增殖、侵襲、遷移。

腫瘤細胞從原發部位脫落，并遷移至其他組織或器官是腫瘤播散最為關鍵的環節[15]，也是腫瘤發生侵襲、遷移的主要原因之一。Wnt信號通路的異常活化參與腫瘤的發生、發展以及轉移過程，E-cadherin是其相關因子之一。當細胞胞膜上的β-catenin減少時，E-cadherin依賴性的細胞黏附功能就會下降，進而使得腫瘤細胞容易從原發部位發生脫離。E-cadherin 被認為是EMT過程中的基礎，而EMT是指上皮細胞失去黏合性和極性，從而獲得轉移和侵襲能力的可逆過程。TCF4是Wnt信號通路中的信號分子，在腫瘤的發生、發展過程中起到重要作用。異常情況下Wnt通路被激活時，β-catenin由細胞質轉移到細胞核內，競爭性結合TCF4，抑制TCF4轉錄激活功能[16-18]，并且同TCF4共同作用促使其下游轉錄因子也被激活，進而誘導細胞癌變[19]。Peng等[20]發現β-catenin/TCF在肝細胞癌中通過激活下游靶基因來促進肝癌細胞的侵襲和遷移。E-cadherin/β-catenin/TCF通路在胃癌與幽門螺桿菌感染關系[21]中有所研究，在腫瘤的侵襲、轉移方面三者之間的關系尚未見報道。差異性基因表達路徑分析顯示，TCF4依賴人神經母細胞瘤，如果敲除TCF4基因，EMT相關的多信號通路和基因會因此而發生不同程度的變異[22]。本組實驗結果顯示，沉默β-catenin表達之后，食管癌細胞Eca-109的侵襲、遷移能力均顯著下降，干擾組中TCF4表達較陰性對照組及空白組均顯著下降(P<0.05)，而E-cadherin的表達量較陰性對照組及空白組均顯著升高(P<0.05)。說明β-catenin蛋白沉默可能通過下調TCF4的表達進而調節E-cadherin的表達使其表達增強進而抑制腫瘤的EMT，阻礙食管癌細胞的侵襲及遷移。

由于基因靶向治療的針對性強，目前在許多腫瘤治療中已成為治療的一種趨勢，食管癌靶向治療也是目前的研究熱點。結合前期研究結果及本組實驗結果，通過沉默β-catenin基因后，TCF4表達下降，兩者結合能力減弱，直接或間接抑制E-cadherin的表達，同時對Wnt信號通路下游靶基因WISP2的抑制作用減弱，導致食管癌細胞增殖、侵襲、遷移能力減弱。但是信號的傳導是多因子參與的多步驟過程，該調控的具體機制還需進一步研究。闡明這些機制，對食管癌的治療和改善預后將提供更多的參考價值，因此我們期待對Wnt/β-catenin信號通路進行深入探討，為食管癌的治療提供更多的有效思路。

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Effect of β-catenin in invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma

QIN Yan-zi1, WANG Xiao-li2, LIU Ming-jun3, WANG Le-le3, SHAN Li-na3, LI Zhuo-ran3, TAO Yi-sheng1

(1DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China;2DepartmentofPathology,RenminHospitalofWeifang,Weifang261000,China;3DepartmentofGeneralMedicine,Grade2012,BengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China)

Purpose To explore the β-catenin role in the process of invasion and metastasis of esophageal cancer. Methods Transfection-effective β-catenin gene segments of siRNA interference in human esophageal Eca-109 cells was used to downregulate β-catenin expression: CCK-8 multiplication experiment was carried out to observe the esophageal cancer cell proliferation. Transwell chambers experiment was used to observe its invasion, migration ability. Western blot was used to detect the expression of WISP2 and TCF4, E-cadherin protein. Results CCK-8 multiplication experiment showed that in the interference group (the efficient transfection of β-catenin down-regulation group by siRNA) cell proliferation ability significantly decreased as compared with the blank control group (the untreated group) and the negative control group (the transfection group meaningless fragments) (P<0.05), and there was no statistical significance between the blank and negative control groups (P>0.05). The invasion and migration ability of the interference group was lower than that in the blank control group and the negative control group (P<0.05) by the transwell chambers experiment. Western blot showed that the protein lever of WISP2 and E-cadherin in interference group was higher than those in the blank control group and the negative control group (P<0.05). TCF4 protein expression in the interference group was lower than that of the blank control group and the negative control group (P<0.05). Conclusions After the β-catenin expression is down-regulated, Wnt signaling pathway-related factors are significantly changed. It can be speculated that the silencing of β-catenin in Wnt signaling pathway may hinder the esophageal cancer cell proliferation by up-regulating E-cadherin expression to obstruct epithelial mesenchymal transition (EMT) and to inhibit tumor cell proliferation. Invasion and metastasis of the tumor are also inhibited by reducing TCF4 expression and promoting WISP2 downstream target genes expression. Therefore, β-catenin gene is expected to be a target for the treatment of esophageal cancer.

esophageal neoplasms; invasion; metastasis; proliferation; β-catenin

國家級大學生創新創業項目(201410367036)、蚌埠醫學院自然科學基金(BYKY1437)

1蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科/蚌埠醫學院病理學教研室，蚌埠 2330042山東省濰坊市人民醫院病理科，濰坊 2610003蚌埠醫學院2012級全科醫學系，蚌埠 233004

秦燕子，女，碩士，講師。E-mail: qyz18725525611@163.com 陶儀聲，女，教授，碩士生導師，通訊作者。Tel:(0552)3070209，E-mail: tys101041@126.com

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.002.html

R 735.1

A

1001-7399(2017)08-0832-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.002

接受日期：2017-04-16