西方許旺酵母菌產雙加氧酶的發酵條件研究

鄭堅強+韓素娜+時錦錦+趙楠+彭新榜+司俊玲+許春平

摘要：將1株西方許旺酵母菌株應用于降解類β-胡蘿卜素產生香味物質的體系中，為生物技術制備香精香料提供研究基礎，對其液態發酵培養基及發酵條件進行優化，確定純種液態發酵最佳培養基組分及發酵條件。以西方許旺酵母為試驗菌株，采用搖瓶發酵的方式，研究培養基組分（碳源、氮源、無機鹽離子）及添加量與發酵培養條件（溫度、初始pH值、接種量、搖床轉速）對菌種產雙加氧酶的情況。結果表明，培養基最優組成為10.00 g/L葡萄糖、10.00 g/L 蛋白胨、5.00 g/L酵母粉、0.20 g/L FeSO4、0.45 g/L MgSO4·7H2O、3.00 g/L NaNO3、0.50 g/L KCl；最佳優化條件為溫度27.90 ℃、起始pH值為7.21、轉速為160.00 r/min、接種量為5.00%，發酵時間為72.00 h，此時酶活性達到1.23 U/mL，5次中心點重復試驗結果穩定可靠；通過響應面分析發現，溫度、起始pH值作用極顯著，溫度和起始pH值交互顯著，客觀反映了微生物的發酵條件。

關鍵詞：西方許旺酵母；雙加氧酶；發酵條件；優化

中圖分類號： TS201.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0124-07

類胡蘿卜素廣泛分布于自然界中，是很多化合物的前體物質，如C13-類胡蘿卜素（非萜類化合物），該化合物包括紫羅酮、二氫大馬酮等，是構成茶葉、玫瑰、葡萄酒等的主要香味物質[1]。這些化合物香味閾值低，其中很多是強有效的香氣化合物，已經引起香精香料行業的極大關注[2]。從植物資源中萃取類胡蘿卜素降解的香味物質生產成本高，而采用生物技術制備的香味物質是純度高的天然化合物[3]。有學者利用泥土中的細菌、絲狀真菌降解類胡蘿卜素轉化為單環、雙環的單萜，但實際應用很少，還沒有任何一個單萜類的生物轉化已經商品化、工業化生產[4-6]。

目前學術研究主要采用微生物固態發酵技術裂解（降解）類胡蘿卜素，產生香味物質[7]。在廣泛的篩選中，發現真菌、酵母菌具有降解類胡蘿卜素的潛在能力。在以金銀花為主要碳源化學成分的培養基中，有19種具有降解葉黃素的菌株（或者菌屬）被分離出來，在這些分離得到的菌種中，有2種在發酵時可產生揮發性化合物[8]。Zorn等研究報道，50多種絲狀真菌、酵母菌能有選擇性地降解β-胡蘿卜素轉化為香味化合物，生物轉化產物為單萜、倍半萜、三萜、四萜等化合物[9-10]。王樹林等從沙棘汁中分離得到1株可降解β-胡蘿卜素的菌株，并對培養基配方及培養條件進行優化[11]。麻俊俠等探索適于β-胡蘿卜素降解葡萄球菌生長的最佳化學合成培養基配方，試驗對培養基中的碳源、氮源、礦物質、各種生長因子等進行了研究，并確定了它們之間的配比，同時對發酵液的粗酶活進行了初步探索[12]。

查閱相關文獻發現，國內外對微生物定向降解類胡蘿卜素產生香味化合物進行了初步研究，沒有進行工業化生物降解類胡蘿卜素制備香味化合物生產的報道。此外，由于篩選的材料不同，導致篩選的菌株不同，菌株與培養基以及富含類胡蘿卜素的原料不同，從而使菌種的發酵條件不同，導致降解類胡蘿卜素生成的香味物質種類和含量有差異。

試驗以筆者所在實驗室篩選的西方許旺酵母菌為培養菌株，研究培養基、發酵條件對微生物產酶的影響情況，從而分析微生物菌體代謝能力及菌種的產酶效果。提高菌株產氧化酶（雙加氧酶）能力，提高該微生物及其酶降解β-胡蘿卜素生成香味成分的含量。試驗目的在于提高該菌株產雙加氧酶能力，為其后續在西方許旺酵母降解富含類胡蘿卜素產品（番茄、枸杞等）生成香味物質的應用中提供研究基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試劑β-胡蘿卜素（分析純，美國Sigma公司）；β-紫羅蘭酮（分析純，美國Sigma公司）；葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸銨、硫酸亞鐵、氯化鈉、石油醚、吐溫20、碳酸氫鈉、乳糖、硼酸、麥芽糖、蔗糖，均為分析純；酵母粉、瓊脂粉、蛋白胨、天冬酰胺、麥芽提取物，均為生物試劑。

1.1.2儀器LDZX-75KBS立式蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SPX-160B-2培養箱（上海福瑪實驗設備有限公司）；QYC-200搖床（上海?，攲嶒炘O備有限公司）；DGX-8053B干燥箱（上海福瑪實驗設備有限公司）；UV765紫外分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；CF16RXI離心機（深圳市瑞鑫達科教儀器貿易部）；DK-S18水浴鍋（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）；QL-866點動儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）等。

1.1.3培養基平板培養基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨 5.00 g/L，麥芽提取物3.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，瓊脂粉1500～20.00 g/L，β-胡蘿卜素80.00 mg/L，121 ℃，滅菌20 min。

種子培養基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，麥芽提取物 3.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，K2HPO4 1.50 g/L，KCl 0.50 g/L，121 ℃，滅菌20 min。

液體發酵培養基：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，麥芽提取物3.00 g/L，酵母粉3.00 g/L，MgSO4 0.50 g/L，NaNO3 3.00 g/L，FeSO4 0.01 g/L，β-胡蘿卜素110.00 mg/L，121 ℃，滅菌20 min。

1.2試驗方法

1.2.1菌體生長曲線的繪制西方許旺酵母菌種活化2代后，接種于150 mL種子培養基三角瓶中，28 ℃、160 r/min避光培養72 h后作為種子液。按5%（體積分數）接種量，接入裝有150 mL發酵培養基的300 mL三角瓶中，于28 ℃、160 r/min 避光培養，每12 h取樣1次，用分光光度計測量吸光度（D600 nm）。記錄吸光度，以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。endprint

1.2.2搖瓶培養及菌種代謝產物的監測在300 mL錐形瓶中裝入100 mL培養基，滅菌并冷卻后，向錐形燒瓶中加入 1.0% 活化的菌液，在避光條件下28 ℃、150 r/min，培養24 h后，將16 mg β-胡蘿卜素、10 g吐溫20溶解在二氯甲烷中，溶劑在旋轉蒸發器中蒸餾除去，抽濾除菌，然后加無菌水稀釋至100 mL，平均加入到錐形瓶中，28 ℃、150 r/min，在避光條件下繼續培養，并且每天對樣品進行分析，剩余的β-胡蘿卜素和代謝物從培養上清液中用二氯甲烷萃取3次，60 ℃水浴蒸發至1 mL，進行GC-MS分析。

1.2.3目標產物GC-MS分析條件色譜條件：毛細管柱：HP-5MS（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度 240 ℃；升溫程序：50 ℃保持1 min，以8 ℃/min升溫到 160 ℃，保持 2 min，再以8 ℃/min升溫到260 ℃，保持 15 min；載氣（He）恒流模式，流量1 mL/min；進樣量2 μL，分流進樣，分流比為25 ∶1。

質譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度160 ℃；質量掃描范圍35～455 m/z[13]。

1.2.4β-胡蘿卜素儲備液的制備避光稱取5 mg β-胡蘿卜素溶于10 mL二氯甲烷中，待β-胡蘿卜素徹底溶解后加入1 g吐溫20進行乳化。在避光條件下，將二氯甲烷徹底揮發干凈，倒入100 mL棕色容量瓶中定容，混合均勻，得到橘黃色清澈的β-胡蘿卜素儲備液備用。

1.2.5β-胡蘿卜素標準曲線的制作分別取β-胡蘿卜素儲備液0、20、40、60、120、180、240、480 μL于棕色容量瓶中加蒸餾水定容至5 mL，以蒸餾水做空白對照，于450 nm處測定其吸光度，所得數據見圖1，得到β-胡蘿卜素溶液濃度與吸光度的線性關系。

β-胡蘿卜素濃度與吸光度之間的線性方程：y=107.04x-0.432 6，決定系數r2=0.992。式中：y為β-胡蘿卜素濃度（μmol/L）；x為吸光度。

1.2.6粗酶液的制備搖瓶發酵后得到發酵液，發酵液 4 ℃、10 000 r/min、離心20 min。上清液即為粗酶液。

1.2.7β-胡蘿卜素的降解率及酶活性的計算取5 mL酶液（37 ℃水浴中保溫）并加入500 μL β-胡蘿卜素儲備液，加入光程1 cm的玻璃比色皿中，以未加β-胡蘿卜素儲備液的粗酶液作對照，立刻在450 nm處測其吸光度，測完后立即在37 ℃下避光水浴，每隔1 min測定1次吸光度。酶活性單位定義：在37 ℃、pH值為6.5條件下1 min降解1 μmol β-胡蘿卜素所需的酶量為1個單位。

β-胡蘿卜素降解率及酶活性的計算公式：

降解率=原有β-胡蘿卜素含量-現有β-胡蘿卜素含量原有β-胡蘿卜素含量；

酶活性=（C0-Ct）×（5.0+0.5）/5.0×t；

C0=初始β-胡蘿卜素含量（μmol/L）；

Ct=t min后β-胡蘿卜素含量（μmol/L）；

t=時間（min）。

1.2.8培養基優選試驗

1.2.8.1培養基組分單因素試驗（1）碳源篩選：分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉為發酵培養基中的唯一碳源，碳源濃度均為2%；氮源篩選：分別以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、（NH4）2SO4為發酵培養基中的唯一氮源，濃度均為10 g/L。葡萄糖添加量篩選：分別以5.00、10.00、1500、20.00、25.00、30.00 g/L 葡萄糖量進行發酵試驗；酵母粉添加量篩選：分別以3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00 g/L酵母粉量進行發酵試驗；蛋白胨篩選：分別以8.00、9.00、1000、11.00、12.00、13.00 g/L蛋白胨含量進行發酵試驗?；罨蟮奈鞣皆S旺酵母接入已滅菌的裝有150 mL培養基的300 mL三角瓶中，接種量5%（體積分數），28 ℃培養72 h后，測定西方許旺酵母酶活性，試驗數據為3次重復試驗平均值。在此基礎上，采用正交試驗優化基礎培養基組成。

（2）微量元素單因素試驗：微量元素在西方許旺酵母生長繁殖和代謝過程中起著重要的作用，影響菌株產酶能力。測定西方許旺酵母酶活性，試驗主要考察Fe2+、Mg2+、Na+ 、K+對菌株產雙加氧酶的影響。FeSO4添加量篩選：分別以 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L FeSO4添加量進行發酵試驗；MgSO4·7H2O添加量篩選：分別以0.40、0.45、0.50、055、0.60 g/L MgSO4·7H2O添加量進行發酵試驗；NaNO3添加量篩選：分別以2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 g/L NaNO3添加量進行發酵試驗；KCl添加量篩選：分別以4.00、4.50、500、5.50、6.00 g/L NaNO3添加量進行發酵試驗。通過測定西方許旺酵母酶活性，研究微量元素的添加量對西方許旺酵母菌株產酶的影響。在此基礎上，采用正交試驗優化微量元素組成。

配制液體發酵培養基前，用0.1 mol/L HCl將微量元素成分配制成使用濃度100倍貯液，即每100 mL 0.1 mol/L HCl溶解一定量的FeSO4、MgSO4·7H2O、NaNO3、KCl，每配制 100 mL 液體發酵培養基取100倍貯液1 mL即可。

1.2.9發酵條件優化試驗以優化的發酵培養基為基礎。培養溫度對菌株產酶的影響：以溫度26.0、27.0、28.0、29.0、30.0 ℃等，于pH值7.0、160 r/min搖床培養72 h。培養基初始pH值對菌株產酶的影響：用0.1 mol/L HCl、NaOH溶液調節培養基初始pH值梯度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于 28 ℃、160 r/min搖床培養72 h。endprint