彝藥雙參多糖的含量測定

王曉芳，梅楨，楊艾，楊莉萍

昆明衛生職業學院

彝藥雙參多糖的含量測定

王曉芳，梅楨，楊艾，楊莉萍

昆明衛生職業學院

目的研究彝族藥雙參中多糖含量的測定方法。方法以葡萄糖為對照，以苯酚-濃硫酸為顯色劑，采用分光光度法于波長488nm處測定多糖含量。結果葡萄糖在20～120ug/ml范圍內線性關系良好,線性回歸方程為A=0.0075c+0.0197,r=0.999 6,平均回收率為100.87%,RSD為2.15%（n=9）。測得雙參中多糖含量為25.82%～41.24%。結論表明雙參中多糖含量較高,具有開發利用價值。

雙參；多糖；苯酚-濃硫酸比色法

雙參為川續斷科植物雙參Triplostegia glandulifera Wall.ex DC.的干燥塊根，又稱蘿卜參、對對參、童子參[1]。是一味彝醫的特色用藥,味苦，性溫，有益腎養肝，健脾寧心之功效，可用于肝腎虧虛，腰膝痠軟，頭暈乏力，不孕不育，月經不調，心悸失眠等癥[1,2]。動物實驗表明，雙參具有明顯的抗應激和降血糖的作用[3,4]。本實驗用超聲提取法從雙參中提取多糖,采用苯酚-濃硫酸法測定其含量。

1.儀器與試劑

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京譜析通用儀器有限責任公司）；SK8200H超聲儀（上海科島超聲儀有限公司）；AL204-IC電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。雙參藥材經昆明衛生職業學院藥劑教研室黃鷹老師鑒定；葡萄糖對照品（上海伯奧生物科技有限公司，編號A1262）；其它試劑均為分析純。

2.實驗方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 雙參多糖的提取與精制稱取雙參粉末30g，置圓底燒瓶中，加石油醚（60～90℃）100ml，75℃超聲30min，脫脂，離心，揮干溶媒，藥渣加蒸餾水400ml，超聲提取20min，離心，減壓濃縮，濃縮液加乙醇使含醇量達80%，冰箱靜置過夜，離心，沉淀先后用乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌，60℃烘干至恒重，即得精制雙參多糖[5]。精密稱取精制雙參多糖100mg，置100ml容量瓶中加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，從中取1ml于10ml容量瓶中定容至刻度，搖勻，即得0.1mg/ml精制雙參多糖溶液，備用。

2.1.2 5%苯酚溶液的配制取苯酚100g,加鋁片0.10g和碳酸氫鈉0.05g，蒸餾，收集182℃餾分。稱取精制苯酚10g，加水溶解，定容于200ml棕色容量瓶中（臨用前配制）。

2.1.3 對照品溶液的配制精密稱取葡萄糖對照品100mg，置100ml容量瓶中加水溶解并稀釋至刻度，即得1mg/ml對照品儲備液。精密取上述儲備液1ml于10ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻即得0.1mg/ml對照品溶液。

2.1.4 樣品溶液的制備樣品粉碎，過40目篩，精密稱取0.5g，置圓底燒瓶中，加蒸餾水20ml，超聲提取兩次，每次30min，離心，殘渣用水洗滌（5ml×3），合并上清液和洗液于100ml容量瓶中，定容，搖勻。精密移取上述液1ml于25ml容量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.2 測量波長的選擇

精密吸取濃度為0.1mg/ml對照品溶液、精制雙參多糖溶液、蒸餾水各1ml于10ml具塞試管中，再各加5%的苯酚溶液1ml，搖勻，并迅速加入濃硫酸5ml，待冷卻后，沸水浴中加熱15min，迅速冷卻至室溫，用分光光度計在200～600nm作全波長掃描，結果兩者在488～490nm范圍內均有最大吸收，圖譜見圖1，所以確定最佳吸收波長為488nm。

圖1 精制多糖與葡萄糖對照品光譜掃描曲線圖

圖2 對照品標準曲線圖

2.3 換算因素的測定

精密移取0.1mg/ml精制雙參多糖溶液1ml，按“2.2.1”依法操作，測定A，用回歸方程計算多糖溶液中折合葡萄糖的濃度，利用公式f=W/（C×D）計算換算因素，得f=1.1687（n=3）。式中W為多糖的質量（ug），C為多糖濃度（ug/ml），D為稀釋因素。樣品測定：精密移取樣品溶液1ml，按“2.2.1”項自“加5%的苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，測定A，用回歸方程計算樣品溶液中折合葡萄糖的濃度，按下式計算樣品中的多糖含量：

多糖含量（%）=C×D×f/W×100（1）

式（1）中,W為供試品的質量（g）,C為供試品液中葡萄糖濃度（ug/ml），D為供試品的稀釋因素,f為換算因素。

2.4 標準曲線的繪制

精密吸取濃度為0.1mg/ml的對照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml分置10ml具塞試管中，依次加蒸餾水補至2ml，按“2.2.1”依法操作，測定A。以吸光度（A）為縱坐標，濃度（c）為橫坐標，繪制標準曲線（見圖2），回歸方程為A=0.0075c+0.0197，r=0.999 6。結果表明，葡萄糖在20.0-120.0ug范圍內線性關系良好。

2.5 精密度實驗

精密吸取同一供試品溶液1.0ml，按“2.2.1”依法操作，連續測定6次，吸光度值分別為0.448、0.448、0.448、0.447、0.446、0.445，得RSD為0.28%，表明精密度良好。

2.6 穩定性實驗精密吸取同一供試品溶液1.0ml，按“2.2.1”依法操作，顯色后于488nm處每隔10min測定一次吸光度值，連續測定1.5h，吸光度值分別為0.496、0.503、0.504、0.503、0.502、0.501、0.500、0.500、0.498，得RSD為0.52%，表明樣品溶液在1.5h內穩定。

2.7 重現性試驗

取同一樣品6份，按“2.1.4”項制備供試品溶液，按“2.2.1”依法操作，測定A，求得多糖的含量分別為：34.71%、36.80%、36.39%、36.96%、35.45%、36.45%，RSD為2.41%，結果表明本實驗重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗

表3 回收率試驗結果（n=9）

精密稱取已知含量的樣品（多糖含量36.13%）粉末9份，按高、中、低分別按下表精密加入葡萄糖對照品溶液，按“2.1.4”制備供試品溶液，按照“2.2.1”依法操作，測定A，計算回收率，結果見表3。結果表明，本實驗確立的方法回收率較好。

2.9 樣品測定

取不同采摘地點的雙參藥材，按“2.1.4”項制備供試品溶液，并按“2.2.1”項自依法操作，測定A，計算樣品中多糖的含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（n=3）

3.討論

超聲技術已經廣泛應用于植物有效成分的提取[6],可以大幅度地提高有效成分的提取率，簡化提取操作步驟，縮短提取時間，提高工作效率，節省溶劑。在實驗過程中，硫酸-苯酚溶液必須現配現用，并放入棕色瓶中避光保存。在測定多糖含量時，保持較高的硫酸濃度非常重要，因為該顯色反應是以對多糖的水解和糠醛反應為基礎，硫酸濃度低，會影響兩種反應的進行，由于樣品中苯酚的加入量會影響硫酸的濃度，故必須控制一個合適的比例。雙參中多糖的含量較高，達27%-40%，楚雄地區的雙參多糖含量明顯低于其他兩個地區，可能是由于該地區采購的藥材為放置多年的陳藥所致。本文對雙參多糖含量進行了測定，為雙參藥材質量評價和進一步開發利用提供依據。

[1]楊本雷，余惠祥，等.中國彝族藥學[M].昆明：云南民族業版社，2004.198-199.

[2]李耕冬，賀廷超.彝醫植物藥[M].四川民出版社，1990.117-118.

[3]劉曉波，郭美仙，徐靜，等.雙參對小鼠抗應激作用的實驗研究[J].現代醫藥衛生，2008，24（9）：1265-1266.

[4]劉曉波,郭美仙,李龍星.雙參降血糖作用的研究[J].云南中醫中藥雜志，2008，29（5）：49-50.

[5]李娜，楊曉杰，李旭業.植物多糖提取技術研究[J].高師理科學刊，2012，32（2）：86-89.

[6]韓勇.超聲波法提取茯苓菌絲體胞內多糖的研究[J].黑龍江農業科學,2013,（6）：112-116

王曉芳（1986-），女，漢族，云南楚雄人，本科，助教，研究方向：藥理學教育；

梅楨（1985-），女，漢族，云南昆明人，本科，講師，研究方向：化學與藥學教育；

楊艾（1988-），女，漢族，云南宣威人，本科，助教，研究方向：藥理學教育。