鐵調(diào)素和IL-6在非酒精性脂肪性肝病大鼠模型肝臟炎癥進(jìn)程中的表達(dá)水平及相關(guān)性分析

趙 睿， 李 娟， 王 亮， 孔 銀， 丁 潔， 王娟霞， 李光明， 張嶺漪

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 肝病科， 蘭州 730030)

鐵調(diào)素和IL-6在非酒精性脂肪性肝病大鼠模型肝臟炎癥進(jìn)程中的表達(dá)水平及相關(guān)性分析

趙 睿， 李 娟， 王 亮， 孔 銀， 丁 潔， 王娟霞， 李光明， 張嶺漪

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 肝病科， 蘭州 730030)

目的利用非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠模型觀察鐵調(diào)素(Hepc)、IL-6在肝臟炎癥進(jìn)程中表達(dá)水平的變化。方法NAFLD肝組織標(biāo)本均來自本課題組前期利用高脂乳劑灌胃法成功構(gòu)建的大鼠NAFLD模型(M組)及同期生理鹽水灌胃替代構(gòu)建的正常大鼠對(duì)照組(C組)。Hepc、IL-6單克隆抗體應(yīng)用免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)4、8、12周M組(M4、M8、M12)和12周C組大鼠肝組織中Hepc、IL-6的表達(dá)水平，同期評(píng)估各組肝脂肪炎癥程度積分。檢測(cè)2組大鼠肝組織Hepc和IL-6的表達(dá)水平，并計(jì)算肝組織NAS積分。多組間比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t相關(guān)法。相關(guān)性分析均采用Pearson相關(guān)法。結(jié)果隨試驗(yàn)周期延長，Hepc和IL-6在M4組、M8組、M12組表達(dá)水平呈逐漸升高的趨勢(shì)，且與C12組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Hepc：0.372±0.216、1.213±0.193、2.390±0.192 vs 0.166±0.192；IL-6：0.499±0.218、1.290±0.210、2.644±0.441 vs 0.240±0.109，P值均<0.05)；M組大鼠肝組織Hepc和IL-6表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.944，P<0.05)；M組大鼠肝組織Hepc和IL-6表達(dá)水平均與NAS呈正相關(guān)(r值分別為0.927和0.907，P值均<0.001)。結(jié)論初步觀察到實(shí)驗(yàn)性NAFLD炎癥進(jìn)程可影響肝組織Hepc、IL-6表達(dá)且Hepc與肝組織炎癥損傷因子IL-6表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)性明顯。Hepc和IL-6作為NAFLD疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子值得進(jìn)一步研究。

脂肪肝； 鐵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)類； 白細(xì)胞介素6

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以肝細(xì)胞脂肪變性和肝脂毒性炎癥為特征的代謝應(yīng)激性肝損傷，鐵代謝紊亂被認(rèn)為是其損傷機(jī)制之一[1]；鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子鐵調(diào)素(hepcidin, Hepc)是鐵代謝調(diào)節(jié)依賴的主要相關(guān)蛋白，在肝細(xì)胞中正常表達(dá)[2]；胰島素抵抗及氧化應(yīng)激不僅是NAFLD形成機(jī)制中重要的打擊因素，同時(shí)可刺激Hepc異常高表達(dá)，致肝組織中鐵異常沉積，后者反過來又促進(jìn)NAFLD炎癥進(jìn)展[3]，其中，細(xì)胞因子IL-6是介導(dǎo)Hepc表達(dá)上調(diào)的主要炎性信號(hào)因子[4]；但是，NAFLD炎癥進(jìn)程與Hepc及IL-6相關(guān)性研究較少。因此，本研究旨在利用NAFLD大鼠模型初步探討Hepc、IL-6在實(shí)驗(yàn)性NAFLD肝臟炎癥進(jìn)程中表達(dá)強(qiáng)度的變化。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 本實(shí)驗(yàn)所用NAFLD大鼠肝組織蠟塊標(biāo)本源于本課題組前期應(yīng)用高脂乳劑灌胃法成功構(gòu)建的NAFLD模型組(M組)和同期應(yīng)用生理鹽水灌胃替代構(gòu)建的正常對(duì)照組(C組)大鼠[5]。

1.2 主要試劑 兔濃縮型單克隆抗體Hepcidin-25 (ab30760)一抗(Abcam公司)；兔濃縮型單克隆抗體IL-6 (ab83339)一抗(Abcam公司)；免疫組化二抗采用通用型試劑(ZSGB-BIO公司)。

1.3 分組 M組分別隨機(jī)選用4周(M4組)、8周(M8組)、12周(M12組)各10只NAFLD大鼠的肝組織蠟塊標(biāo)本；C組(C12組)為10只正常對(duì)照組大鼠的肝組織蠟塊標(biāo)本(本研究?jī)H選取12周大鼠作為對(duì)照觀察)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 檢測(cè)NAFLD大鼠肝組織Hepc、IL-6的表達(dá)

標(biāo)本常規(guī)脫蠟、水化、3%雙氧水、37 ℃孵育、PBS沖洗、正常山羊血清封閉、37 ℃孵育；根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取Hepcidin-25一抗?jié)舛?∶100、單克隆抗體IL-6一抗?jié)舛?∶50；應(yīng)用免疫組化分別檢測(cè)M組(M4、M8、M12)和C組大鼠肝組織(各10張2～5 μm切片)Hepc、IL-6表達(dá)結(jié)果，采用免疫組化積分計(jì)量觀察方法:(1)每張切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)采集10個(gè)視野(避開邊緣效應(yīng))，每個(gè)觀察視野包含一個(gè)匯管區(qū)或一個(gè)中央靜脈并選擇細(xì)胞表達(dá)最密的地方觀察，計(jì)算Hepc、IL-6的陽性細(xì)胞數(shù)百分比，以百分?jǐn)?shù)表示；(2)同時(shí)觀察陽性著色強(qiáng)度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(3)相乘計(jì)算綜合積分，采用計(jì)算公式：(+)%×1 +(++)%×2+(+++)%×3，總數(shù)值<1.0者為(+)，1.0～1.5者為(++)， >1.5者為(+++)，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野[6]。

1.4.2 NAFLD大鼠肝組織炎癥程度積分 依據(jù)《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[7]中NAFLD炎癥程度積分(NAFLD activity score，NAS)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)肝組織病理切片在高倍鏡下進(jìn)行觀察。(1)肝細(xì)胞脂肪變NAS0～8分；(2)小葉內(nèi)炎癥NAS(高倍鏡下壞死灶數(shù))，0分(無)，1分(<2個(gè))，2分(2～4個(gè))，3分(>3個(gè))；(3)肝細(xì)胞氣球樣變：0分(無)，1分(少見)，2分(多見)；NAS<3分可診斷細(xì)胞脂肪變性，NAS>4分診斷非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD大鼠肝組織Hepc、IL-6表達(dá)水平的變化 與C組相比，M組Hepc和IL-6表達(dá)均隨著時(shí)間的延長明顯高表達(dá)，且炎癥表現(xiàn)也越來越強(qiáng)(圖1)。Hepc在M4組、M8組、M12組表達(dá)水平呈逐漸升高的趨勢(shì)，且與C12組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，M8組、M12組與M4比較，M12組與M8組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；IL-6在M4組、M8組、M12組表達(dá)水平呈逐漸升高的趨勢(shì)，且與C12組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，M12組與M4組、M8組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

2.2 NAFLD大鼠肝組織Hepc和IL-6的相關(guān)性 對(duì)M組(M4、M8、M12)肝組織Hepc與IL-6進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示Hepc與IL-6呈正相關(guān)(r=0.944，P<0.05)(圖2)。

2.3 NAFLD大鼠NAS HE染色觀察到M4組肝細(xì)胞索以肝小葉中央靜脈為中心，呈放射狀排列，匯管區(qū)未見炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生，肝細(xì)胞可見少量脂肪空泡形成；M8組肝細(xì)胞大部分脂肪變性，細(xì)胞增大，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不一、數(shù)量不等的脂肪空泡，細(xì)胞核被推向周邊，匯管區(qū)部分炎癥細(xì)胞浸潤；M12肝腺泡3區(qū)大泡性或以大泡為主的混合性肝細(xì)胞脂肪變，伴有肝細(xì)胞氣球樣變、小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞，但未見竇周纖維化；C12組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無脂肪空泡形成(圖3)。各組NAS積分見表2，M4組NAS主要集中在2分，M8組NAS主要集中在4和5分，M12組NAS主要集中在6分，而C12組NAS主要集中在0分。

圖1 NAFLD大鼠肝組織M組和C組Hepc、IL-6表達(dá)水平變化(免疫組化，×400) a、c、e、g：Hepc-C12、M4、M8、M12；b、d、f、h：IL-16-C12、M4、M8、M12

注：與C12組比較，1)P<0.05；與M4組比較，2)P<0.05；與M8組比較，3)P<0.05

圖2 NAFLD大鼠M組肝組織Hepc與IL-6綜合計(jì)量積分的相關(guān)性

圖3 NAFLD大鼠M組和C組大鼠肝組織形態(tài)變化(HE染色，×400) a: M4；b:M8；c:M12; d: C12，細(xì)紅色箭頭表示炎癥細(xì)胞浸潤的部分， 炎癥細(xì)胞被染成藍(lán)色并聚集；粗紅色箭頭表示肝細(xì)胞氣球樣變：細(xì)胞極度水腫，胞核腫脹，被推向周邊

2.4 NAFLD大鼠肝組織Hepc、IL-6表達(dá)水平與NAS積分的相關(guān)性 NAFLD大鼠肝組織Hepc、IL-6表達(dá)水平與NAFLD肝組織NAS積分均呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.927、0.907，P值均<0.001)(圖4)。

圖4 Hepc、IL-6綜合計(jì)量積分與NAS積分的相關(guān)性

3 討論

NAFLD是一組多病理狀態(tài)的慢性炎癥性肝病，從肝脂肪變性到更具進(jìn)展性的疾病狀態(tài)包括NASH和肝硬化，許多患者可能最終進(jìn)展至肝衰竭和肝細(xì)胞癌[8-9]。肝臟是體內(nèi)鐵代謝的重要器官，肝細(xì)胞分泌鐵代謝調(diào)節(jié)依賴相關(guān)蛋白，其中Hepc的正常表達(dá)是維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)最主要的物質(zhì)。NAFLD和鐵代謝之間的關(guān)系仍然存在爭(zhēng)議。盡管近期有研究[10]表明肥胖、NAFLD/NASH引發(fā)的肝臟慢性低水平炎癥狀態(tài)可致肝細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)定受到破壞，反過來又增加了肝臟Hepc的產(chǎn)生。然而，迄今為止尚無更多的研究證實(shí)NAFLD炎癥進(jìn)程中Hepc及IL-6表達(dá)的變化。

NAFLD所產(chǎn)生的一系列病理狀態(tài)勢(shì)必會(huì)引起體內(nèi)相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)生一定的顯著變化，其中IL-6就是這一病理過程中重要的致炎因子之一。IL-6是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等產(chǎn)生，可能在NAFLD 疾病的發(fā)生與發(fā)展中起到一定的作用，同時(shí)又可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞浸潤。IL-6炎癥因子水平的升高是 NAFLD 患者普遍存在的一個(gè)現(xiàn)象，并對(duì)NAFLD的病情進(jìn)展起到正反饋的效應(yīng)，即隨著脂肪肝程度的逐漸加重IL-6的表達(dá)水平也逐漸增加[11]，這一點(diǎn)在本研究結(jié)果中也得到了進(jìn)一步證實(shí),同期觀察到IL-6隨著脂肪變性及炎癥程度的進(jìn)展而逐漸加深，與疾病的進(jìn)程呈正相關(guān)。Hepc被認(rèn)為是一種介導(dǎo)與感染和炎癥相關(guān)的急性期蛋白，Ganz等[12]闡述了IL-6是Hepc在肝臟表達(dá)的信號(hào)通路中的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子，IL-6可以通過與其相應(yīng)的受體結(jié)合并通過一定的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響Hepc的表達(dá)。進(jìn)一步研究[13]顯示，IL-6可能是通過BMP/SMD信號(hào)通路的參與或STAT3通路來刺激Hepc轉(zhuǎn)錄。盡管本實(shí)驗(yàn)在大鼠NAFLD模型中初步觀察到實(shí)驗(yàn)性NAFLD炎癥進(jìn)程可影響肝組織Hepc，IL-6表達(dá)上調(diào)且Hepc與肝組織炎癥損傷因子IL-6表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)性明顯，但在NAFLD肝臟炎癥中Hepc與IL-6之間相互作用的關(guān)系還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，NAFLD病情進(jìn)展與肝臟炎癥程度息息相關(guān)，但目前仍缺乏判斷NAFLD炎癥程度可靠的血清生物學(xué)指標(biāo)，血清Hepc、IL-6是否可做為NAFLD疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子值得進(jìn)一步研究。

[1] DATZ C, FELDER TK, NIEDERSEER D, et al. Iron homeostasis in the metabolic syndrome[J]. Eur J Clin Investig, 2013, 43(2): 215-224.

[2] DONGIOVANNI P, FRACANZANI AL, FARGION S, et.al. Iron in fatty liver and in the metabolic syndrome: a promising therapeutic target[J]. Hepatol, 2011, 55(2): 920-932.

[3] ANTONELLO P. Hepcidin in human iron disorders: therapeutic implications[J]. Hepatology, 2011, 54(2): 173-181.

[4] WANG J, PANTOPOULOS K. Regulation of cellular iron metabolism[J]. Biochem, 2011, 434(2): 365-381.

[5] DING J, WANG L, LI J, et al. Reliability of metabolic and pathologic parameters in the high fat diet-induced nonalcoholic fatty liver disease rat model established by gastric perfusion[J]. J Clin Hepatol, 2012, 7(2): 531-534. (in Chinese) 丁潔, 王亮, 李娟, 等. 高脂乳劑灌胃構(gòu)建大鼠非酒精性脂肪肝病模型可靠性的再研究[J].臨床肝膽病雜志, 2012, 7(2): 531-534.

[6] FU Q, LI P, XIONG F, et al. Dicussion of enhancement of normal SP immunohistochemical staining[J]. J Hubei Univ Chin Med, 2013, 15(5): 24-26. (in Chinese) 富青, 李萍, 熊凡, 等. 改良常規(guī)SP免疫組化染色法的探討[J]. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 15(5): 24-26.

[7] Group of Fatty Liver and Alcoholic Liver Diseases, Society of Hepatology, Chinese Medical Association. Guidelines for management of non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Hepatol, 2010, 26(2): 120-124.(in Chinese) 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì). 非酒精性脂肪性肝病診療指南[J]. 臨床肝膽病雜志, 2010, 26(2): 120-124.

[8] AIGNER E, WEISS G, DATZ C. Dysregulation of iron and copper homeostasis in nonalcoholic fatty liver[J]. World J Hepatol, 2015, 7(2): 177-188.

[9] WANG FG, LIANG WF, XI JJ. Establishment and applications of non-alcoholic steatohepatitis animal models[J]. Chin J Clin Pharmacol Ther, 2015, 20(7): 835-840. (in Chinese) 王福根, 梁偉峰, 席建軍, 等. 非酒精性脂肪性肝炎動(dòng)物模型的建立與應(yīng)用[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2015, 20(7): 835-840.

[10] BOQA S, ALKIN H, ALKIN C, et.al. The relationship of serum hemojuvelin and hepcidin levels with iron overload in nonalcoholic fatty liver disease[J]. Gastrointestin Liver Dis, 2015, 24(3): 293-300.

[11] RAVASI G, PELUCCHI S, TROMBINI P, et al. Hepcidin expression in iron overload diseases in variably moclulated by circulating[J]. PLos One, 2012, 7(5): e36425.

[12] GANZ T. Hepcidin and iron regulation,10 years later[J]. Blood, 2011, 117(17): 4425-4433.

[13] GANZ T. Hepcidin, a key regulator of iron metabolism and mediator of anemia of inflammation[J]. Blood, 2003, 102(3): 783-788.

引證本文：ZHAO R, LI J, WANG L, et al. Expression of hepcidin and interleukin-6 and their correlation in liver inflammation process in a rat model of nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(9): 1774-1777. (in Chinese) 趙睿， 李娟， 王亮， 等. 鐵調(diào)素和IL-6在非酒精性脂肪性肝病大鼠模型肝臟炎癥進(jìn)程中的表達(dá)水平及相關(guān)性分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(9): 1774-1777.

(本文編輯：王 瑩)

Expressionofhepcidinandinterleukin-6andtheircorrelationinliverinflammationprocessinaratmodelofnonalcoholicfattyliverdisease

ZHAORui,LIJuan,WANGLiang,etal.

(DepartmentofHepatology,LanzhouUniversitySecondHospital,Lanzhou730030,China)

ObjectiveTo investigate the changes in the expression of hepcidin (Hepc) and interleukin-6 (IL-6) in liver inflammation process in a rat model of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).MethodsThe rats were given high-fat emulsion by gavage to establish the model of NAFLD (group M) and normal rats were given normal saline by gavage as controls (group C). Liver tissue samples were collected from these rats, and immunohistochemistry was used to measure the expression of Hepc and IL-6 in liver tissue in group M at 4, 8, and 12 weeks (M4, M8, and M12groups) and in group C at 12 weeks (C12group). The NAFLD activity score (NAS) was assessed for both groups. The expression of Hepc and IL-6 in liver tissue was measured, and NAS was calculated. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for comparison between two groups. Pearson correlation analysis was also performed.ResultsOver the course of treatment, the M4, M8, and M12groups had gradual increases in the expression of Hepc and IL-6, and there were significant differences between these groups and the C12group (Hepc: 0.372±0.216/1.213±0.193/2.390±0.192 vs 0.166±0.192, allP<0.05; IL-6: 0.499±0.218/1.290±0.210/2.644±0.441 vs 0.240±0.109, allP<0.05). In group M, the expression of Hepc was positively correlated with that of IL-6 (r=0.944,P<0.05), and the expression Hepc and IL-6 was positively correlated with NAS (r=0.927 and 0.907, bothP<0.001).ConclusionBased on the results of this preliminary study, liver inflammation process in NAFLD can upregulate the expression of Hepc and IL-6 in liver tissue, and Hepc is significantly correlated with the inflammatory factor IL-6. Further studies are needed to investigate the roles of Hepc and IL-6 in predicting the progression of NAFLD.Keywords：fater liver; iron-regulatory proteins; interleukin-6

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.09.030

2017-06-10；

：2017-07-10。

2014年甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(145RJZA147)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(223000-861240)

趙睿(1980-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事非酒精性脂肪性肝病的研究。

張嶺漪，電子信箱: zhanglymd@126.com。

R575.5

：A

：1001-5256(2017)09-1774-04