細胞塊在宮頸液基細胞學中的應用

周 立，李紹剛，殷偉杰，徐海苗

細胞塊在宮頸液基細胞學中的應用

周 立1，李紹剛1，殷偉杰1，徐海苗2

目的探討細胞塊(cell block, CB)在宮頸液基細胞學(liquid-based preparation, LBP)中的應用價值。方法選擇LBP陽性標本285例，其中高危HPV 16型45例、HPV 18型58例，HPV高危其他型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)182例，同時制作成CB并行陰道鏡活檢247例，最終均以組織學診斷為金標準。結果對于非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cells, ASC)，應用LBP與LBP+CB檢測同時陽性的組織學陽性符合率差異有顯著性(72.3%±2.3%vs83.2%±1.1%，P<0.01)，其中診斷為非典型鱗狀上皮細胞-意義不明的(atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US)標本中，LBP與LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率分別為66.28%(57/86)、78.85%(41/52)；診斷為非典型鱗狀上皮細胞-不除外高級別鱗狀上皮內病變(atypical squamous cells,cannot exclude hsil, ASC-H)標本中，LBP與LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率分別為82.98%(39/47)、89.74%(35/39)。對于低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)，LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率比LBP高，但差異無統計學意義(P>0.05)；而對≥高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)和非典型腺細胞(atypical glandular cells, AGC)，LBP與LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率一致；在62例LBP診斷LSIL標本中，CB診斷分別為無上皮內病變或惡性病變(negative for squamous intraepithelial lesions or malignancy, NILM) 2例、ASC-US 7例、ASC-H 10例、LSIL 33例、HSIL 10例；對于50例LBP診斷HSIL標本中，CB診斷分別為ASC-US 2例、ASC-H 11例、LSIL 5例、HSIL 30例、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)2例。HSIL、NILM、LSIL組中p16表達差異有顯著性(P<0.05)。另外，p16在HSIL組中的陽性表達明顯高于LSIL組。結論CB在LBP中的應用，可以提高宮頸癌篩查的組織學陽性符合率，也可作為臨床高度懷疑有病變或高危HPV而LBP未見陽性的一種補充，值得在臨床細胞病理學中推廣。

細胞塊；宮頸液基細胞學；組織學陽性符合率；p16

子宮頸癌是我國婦女最常見的惡性腫瘤之一，近年其發病率呈上升和年輕化的趨勢。因此，子宮頸癌的早期診斷十分重要[1]。目前，臨床常用方法為宮頸液基細胞學(liquid-based preparation, LBP)檢查，細胞涂片的診斷中仍然存在相當數量的假陽性和假陰性[2]。細胞塊(cell block, CB)是重要的細胞學檢查技術，其不僅有助于觀察細胞團的結構，而且還可以做免疫組化和分子病理檢查，已被越來越多地應用于各種細胞學檢查中[3]。本文著重探討CB在LBP中的應用價值，旨在提高LBP的陽性符合率。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集寧波市奉化區人民醫院2013年9月～2014年6月選擇LBP與高危HPV型雙陽性標本285例，高危HPV 16型45例、HPV 18型58例，HPV高危其他型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)182例；制作成CB并行陰道鏡活檢247例，其中非典型鱗狀上皮細胞-意義不明的(atypical squamous cells of undetermined significance, ASC-US)86例、非典型鱗狀上皮細胞-不除外高級別鱗狀上皮內病變的(atypical squamous cells, cannot exclude hsil, ASC-H)47例、低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)62例、≥高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)50例、非典型腺細胞(atypical glandular cells, AGC)2例；輕度糜爛64例，中度糜爛80例，重度糜爛103例；患者年齡19～70歲，平均43.2歲，30～49歲為高發年齡。

1.2方法

1.2.1LBP制作 細胞學標本采用美生液基細胞學制片機制片，95%乙醇固定，巴氏染色，根據TBS診斷標準簽發病理學報告，并將剩余標本制成CB。

1.2.2HPV檢測 采用羅氏(Roche)Cobas 4800 HPV檢測技術。

1.2.3CB制作 將滿足LBP制片后剩余的標本倒入10 mL試管，離心沉淀(2 500～3 000 r/min，5 min)；若標本為血性，應進行預處理，沉淀物用冰醋酸乙醇液(5 mL冰醋酸、95 mL 25%乙醇)清洗振蕩(1 000 r/min，5～10 min)，離心沉淀(1 000～1 500 r/min，10 min)；加入10%中性福爾馬林10 mL，細胞懸浮固定1 h，離心沉淀(2 500～3 000 r/min)，5 min；吸干上清液，加入95%乙醇，離心沉淀(3 000 r/min，靜止30 min使細胞凝成團塊，棄上清液，用棉簽輕輕將CB取出；用包埋紙將CB包埋，放入100%乙醇中脫水，二甲苯透明，浸蠟后包埋成塊切片。

1.2.4免疫組化法 即用型p16鼠抗人單克隆抗體購自福州邁新公司。所有CB連續3 μm厚切片，于60 ℃烘干1 h，免疫組化采用SP法，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固，置顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性標本作為陽性對照。

1.3結果判斷

1.3.1細胞學診斷 采用TBS分級系統[4]，即：無上皮內病變或惡性病變(negative for squamous intraepithelial lesions or malignancy, NILM)、ASC-US、ASC-H、LSIL、HSIL、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)、 AGC、腺癌。

1.3.2陰道鏡檢查并取活檢組織學診斷 采用美國WAFCACH雙目陰道鏡，專人檢查，分別將醋酸白試驗及碘試驗圖像存入電腦或打印存檔，同時在其監視下對異常圖像處進行多點活檢，如無異常圖像者進行子宮頸3、6、9、12點處活檢送病理檢查。組織學診斷：(1)正常或炎癥；(2)子宮頸上皮內病變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)，按輕、中、重分為CIN 1、CIN 2、CIN 3或原位癌(carcinoma in situ, CIS)；(3)浸潤癌，組織病理陽性診斷是CIN 1及以上病變。

1.3.3HPV檢測診斷 診斷標準：140為陰性。

1.3.4免疫組化判斷 p16陽性細胞定位于細胞核和細胞質，呈棕黃色顆粒，由兩名資深病理醫師根據染色強度和染色細胞百分比分別進行評定和分析，結果判斷均采用統一評分標準和雙盲法。 按照陽性細胞數比例分：<1%為0分；1%～9%為1分；10%～33%為2分；34%～66%為3分；>66%為4分。依據染色強度分：無著色為0分；弱著色為1分；中等強度著色為2分；強著色為3分。將兩項得分相乘：0分為(- )，1～4分(+)，5～8分為()，9～12分為()。

1.4統計學方法診斷以病理活檢為標準，各組資料以mean±S.E.M表示，采用SPSS 11.5軟件對檢測結果進行two-way ANOVE方差分析，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異極其顯著。

2 結果

2.1LBP陽性標本中LBP與LBP+CB的組織學分析在ASC中，LBP與LBP+CB的檢測陽性率差異有顯著性(72.3%±2.3%vs83.2%±1.1%，P<0.01)；在LSIL中，LBP+CB的組織學陽性率比LBP稍高，但差異無統計學意義(P>0.05)；而對≥HSIL和AGC，LBP與LBP+CB的檢測陽性率基本相當(圖1)。

圖1 LBP陽性標本中兩組組織學診斷比較(n=247)

2.2ASC標本中LBP與LBP+CB的組織學診斷比較133例ASC標本中ASC-US 86例、ASC-H 47例。ASC-US中LBP與LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率分別為66.28%(57/86)、78.85%(41/52)；ASC-H中LBP與LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率分別為82.98%(39/47)、89.74%(35/39)，兩組比較差異有顯著性(P<0.05，表1)。

表1 ASC標本中兩組組織學診斷比較(n=133)

2.3LBP診斷為鱗狀上皮內病變中對應CB的結果在62例LBP診斷LSIL標本中，CB診斷分別為NILM 2例、ASC-US 7例、ASC-H 10例、LSIL 33例、HSIL 10例；在50例LBP診斷HSIL標本中，CB診斷分別為ASC-US 2例、ASC-H 11例、LSIL 5例、HSIL 30例、SCC 2例(表2)。

表2 LBP診斷為鱗狀上皮內病變標本中對應CB的結果(n=112)

2.4p16的表達p16在對照組中黏液柱狀上皮和鱗狀上皮細胞均呈陰性。在15例CB陰性標本中，6例標本呈弱陽性，占40.00%；在10例LSIL標本中，7例標本呈陽性，占70.00%；在20例HSIL標本中，19例標本呈陽性，占95.00%。HSIL、NILM、LSIL組中p16表達差異有顯著性(P<0.05，圖2)。另外，p16在HSIL組中的陽性表達明顯高于LSIL組(圖3)。

3 討論

LBP是子宮頸癌及癌前病變的初篩法，但其在一些因素的影響下，仍存在一定的假陰性和假陽性。在假陰性病例中，主要是由于血性/炎性的背景造成的[5]；假陽性的主要因素包括以下方面[6]：(1)由于炎癥、感染，出現化生、修復、萎縮細胞、細胞核較大或細胞質減少的細胞，可能誤診為病變細胞。(2)細胞學查見陽性細胞但陰道鏡活檢未取到病變部位。

圖2 CB中p16的表達

ABCD

圖3p16的表達，SP法：A.LSIL；B.HSIL；C.SCC；D.原位腺癌

CB在HE染色形態與文獻報道相似[7]：細胞境界、核膜、核染色質、核仁清楚；也有一定的巢狀、片狀、管狀結構和排列方式，減少標本中的血液、黏液、炎癥細胞等干擾因素；CB也為免疫組化和分子病理學創造條件。本組發現HSIL、NILM、LSIL組中p16表達，差異有顯著性(P<0.05)。另外，p16在HSIL組中的陽性表達明顯高于LSIL組，且陽性定位準確，著色優良，與文獻報道一致[8]，但針對15例CB陰性標本中，6例標本呈弱陽性，可能是由于病毒感染初期，細胞形態改變不明顯或子宮頸取材未取到典型病灶有關[9]。對于病變細胞量較少的標本，較難制成CB或者CB陽性率下降。

本實驗發現LBP與LBP+CB的組織學陽性符合率分別為82.99%(205/247)、90.73%(186/205)，兩者相比差異有顯著性(χ2=5.74，P<0.05)。在ASC中，LBP與LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率差異有顯著性，其中診斷為ASC-US標本中，LBP與LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率分別為66.28%(57/86)、78.85%(41/52)；診斷為ASC-H標本中，LBP與LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率分別為82.98%(39/47)、89.74%(35/39)。LSIL中LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率較LBP稍高，但差異無統計學意義(P>0.05)；而對于≥HSIL和AGC，LBP與LBP+CB同時陽性的組織學陽性符合率基本相當；在62例LBP診斷LSIL標本中，CB分別診斷NILM 2例、ASC-US 7例、ASC-H 10例、LSIL 33例、HSIL 10例；對于50例LBP診斷HSIL標本中，CB分別診斷為ASC-US 2例、ASC-H 11例、LSIL 5例、HSIL 30例、SCC 2例。

綜上所述，應用CB制作提高了子宮頸癌篩查的組織學陽性符合率，可作為臨床高度懷疑有病變或是高危HPV型而LBP未發現陽性的補充檢測技術，值得在臨床細胞病理學中推廣。

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時間：2017-7-18 11:52 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170718.1152.020.html

1浙江省寧波市奉化區人民醫院病理科 3155002浙江省腫瘤醫院病理科，杭州 310022

周 立，男，技師。E-mail: 826346947@qq.com 徐海苗，男，碩士生導師，主任醫師，通訊作者。E-mail: xuhaimiao@126.com

R 737.3

:B

1001-7399(2017)07-0790-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.020

接受日期：2017-05-09