桔梗皂苷D聯(lián)合伊馬替尼對K562細(xì)胞的增殖抑制作用及機制研究

代群 葛宇清

●論 著

桔梗皂苷D聯(lián)合伊馬替尼對K562細(xì)胞的增殖抑制作用及機制研究

代群 葛宇清

目的 探討桔梗皂甙D（p latycod in，PD）與伊馬替尼（imatinib，IM）聯(lián)合用藥抑制慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562的作用及機制研究。方法 體外培養(yǎng)CML細(xì)胞株K562，CCK-8測定PD和IM單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測Annexin V/PI標(biāo)記的細(xì)胞凋亡率，Western b lot方法檢測cleaved casp ase-3、cleaved caspase-9、PARP、cleaved PARP、Bcr/ab l、p-AKT、p-mTOR蛋白表達。結(jié)果 聯(lián)合用藥組對K562細(xì)胞的增殖抑制作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率較單獨用藥組效果明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與單藥組比較，聯(lián)合用藥組可以明顯上調(diào)cleaved casp ase-3、cleaved casp ase-9、cleaved PARP蛋白表達，同時下調(diào)PARP、Bcr/abl、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或0.05）。結(jié)論PD與IM聯(lián)合用藥在抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制Bcr/ab l蛋白和PI3K/AKT/mTOR信號通路方面明顯優(yōu)于單獨用藥。

梗皂甙D 伊馬替尼 K562 Bcr/ab l融合基因 PI3K//AKT/mTOR信號途徑

慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myelogenous leukemia, CML）是一種多能造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病。Bcr/abl融合基因表達的蛋白具有異常的絡(luò)氨酸蛋白激酶活性，能激活下游多種信號傳導(dǎo)，使白血病細(xì)胞具有較強的增殖和抗凋亡能力[1]。盡管臨床應(yīng)用Bcr/abl抑制劑進行治療取得很好的療效，但慢性期CML患者出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象較為普遍，且臨床復(fù)發(fā)率較高[2-3]。因此，發(fā)現(xiàn)新藥物、提出新的臨床治療方法顯得尤為重要。聯(lián)合用藥是治療腫瘤的新趨勢，體內(nèi)外研究證實聯(lián)合用藥可以提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，增強療效，減少化療藥物的用量[4]。桔梗皂苷D（platycodin，PD）是從桔梗中提取的主要活性成分，前期研究發(fā)現(xiàn)PD有抑制白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用[5]。本文旨在探討低劑量PD聯(lián)合Bcr/abl酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼（imatinib，IM）對K562細(xì)胞作用的分子機制。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料 人CML細(xì)胞株K562購自中科院上海細(xì)胞生物研究所。PD購自成都曼思特生物科技有限公司（批號15030619，純度＞98%），利用二甲基亞砜（DMSO）配置成50μmol/L的工作母液；IM（北京諾華制藥有限公司）利用二甲基亞砜（DMSO）配置成10μmol/L的工作母液；胎牛血清購自美國Giboc公司（批號：1227693）；RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)基購自杭州科易生物技術(shù)有限公司（批號：2016011603）；CCK-8試劑盒為日本Dojindo公司產(chǎn)品（批號：KM671）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司（批號：5306537）；抗體cleaved caspase-3（9661S）、cleaved caspase-9、PARP、cleaved PARP、Bcr/abl、p-AKT、p-mTOR均購自美國Cell Signal公司；β-actin及抗兔和抗鼠的二抗均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖活性檢測 采用CCK8法，設(shè)加入的藥物終濃度為10μmol/L PD的單藥組和0.5μmol/L IM的單藥組及兩者聯(lián)合用藥組，并設(shè)立不加任何藥物的空白對照組（control），均培養(yǎng)24h。收集對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，按照上述分組情況加入藥物，每組設(shè)置3個復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入10μl CCK-8試劑，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶標(biāo)儀450nm處檢測吸光光度值（OD值），根據(jù)OD值計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=給藥孔平均值/對照孔平均值×100%，并作量效曲線，求出藥物對細(xì)胞50%生長抑制濃度（IC50）。

1.2.2 細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)分析，取上述4組K562細(xì)胞，以5×104/ml密度接種于6孔板，每孔1ml。按試劑盒說明書進行操作，冷PBS緩沖液洗2次，重懸于1×結(jié)合緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/L。取100μl細(xì)胞懸液加5μl Annexin-V FITC標(biāo)記液和5μl碘化丙啶（PI，50μg/ml）混勻，室溫避光孵育15min后，加400μl結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、PARP、cleaved-PARP表達檢測 采用Western-Blot法，收集4組K562細(xì)胞（每組2×106個細(xì)胞），PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液100μl，冰上裂解30min，12 000r/min離心15min，用BCA方法定量蛋白濃度，取30μg蛋白，加入上樣緩沖液，100℃變性10min，進行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳后，恒流260mA、90～120min將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1h后加入一抗，4℃孵育過夜，用TBST緩沖液漂洗膜3次，10min/次；再使用對應(yīng)的二抗室溫孵育2h，TBST緩沖液漂洗膜3次，10min/次，過氧化物酶法顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集和分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 PD和IM單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞存活率的影響 見圖1、2。

圖1 IM對K562細(xì)胞存活率的影響（與空白對照組比較，**P＜0.01）

圖2 PD和IM單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞存活率的影響（與聯(lián)合用藥組比較，**P＜0.01）

由圖1可見，IM處理細(xì)胞24h對K562細(xì)胞增殖有抑制作用，該作用呈劑量依賴性，0.1、0.2、0.5、1、2μmol/L IM處理K562細(xì)胞24h，細(xì)胞存活率分別為（98.34±3.96）%、（92.24±4.62）%、（83.35±4.12）%、（39.62±5.34）%、（26.73±3.67）%，IM對細(xì)胞增殖有抑制作用，且呈劑量依賴性，1、2μmol/L的IM明顯抑制細(xì)胞增殖，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。IM的IC50為（0.97±0.27）μmol/L，PD的IC50為（23.63±0.51）μmol/L[4]。由圖2可見，與空白對照組、PD單藥組、IM單藥組相比，聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率顯著降低（均P＜0.01）。

2.2 PD和IM單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞凋亡率的影響 見圖3。

圖3 PD和IM單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞凋亡率的影響（與聯(lián)合用藥照組比較，**P＜0.01）

由圖3可見，空白對照組細(xì)胞凋亡率（3.4±2.7）%、PD單藥組（12.9±4.6）%、IM單藥組（10.6±5.4）%，聯(lián)合用藥組（33.6±5.2）%，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率顯著高于其余3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.3 PD和IM單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 見圖4。

圖4 PD和IM單藥及聯(lián)合用藥對K562細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響（與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與PD、IM單藥組比較，△P＜0.05）

由圖4可見，與空白對照組、PD單藥組、IM單藥組相比，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和cleaved-PARP表達明顯上調(diào)，總PARP表達顯著下調(diào)。半定量分析結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組與空白對照組、PD單藥組、IM單藥組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

2.4 PD對K562細(xì)胞Bcr/abl融合蛋白及下游PI3K/ AKT/mTOR信號通路的影響 見圖5。

圖5 PD對K562細(xì)胞Bcr/abl、p-AKT、p-mTOR的影響（與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖5可見，隨著PD濃度的增加，Bcr/abl、pAKT、pmTOR蛋白表達明顯下調(diào)。半定量分析結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增高，15、20μmol/L的PD抑制作用與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

2.5 PD和IM單藥及聯(lián)合用藥對Bcr/abl和PIK/AKT/ mTOR信號通路蛋白表達的影響 見圖6。

由圖6可見，與空白對照組、PD單藥組、IM單藥組相比，聯(lián)合用藥組Bcr/abl、p-AKT、p-mTOR蛋白表達明顯下調(diào)。半定量分析結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組與空白組、PD單藥組、IM單藥組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

3 討論

CML是起源于造血體統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病機制為Bcr/abl融合基因?qū)е吕野彼峒っ富钚栽鰪奫6]。IM是一種酪氨酸激酶抑制劑（turosine kinase inhibitors，TKI），目前作為治療CML的一線藥物應(yīng)用于臨床，與傳統(tǒng)治療藥物羥基脲、沙利度胺、干擾素比較，具有很好的治療效果[7]。但臨床發(fā)現(xiàn)初始治療有效率高達80%的慢性期患者用藥1年后出現(xiàn)繼發(fā)耐藥率約20%，停藥2年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高至69%[2-3]。研究表明患者對IM發(fā)生耐藥是多種機制的綜合結(jié)果，且過程復(fù)雜，其具體機制也有待研究。尋求治療CML的新藥或協(xié)同IM治療的新方案，減少其耐藥的發(fā)生，提高療效并改善患者預(yù)后成了當(dāng)前急需解決的問題。針對其耐藥的發(fā)生，文獻報道聯(lián)合傳統(tǒng)的中藥提取物，明顯提高CML細(xì)胞對IM敏感性，聯(lián)合用藥可以提高IM的治療效果，發(fā)揮協(xié)同治療作用[8-9]。PD是常用傳統(tǒng)中藥桔梗的主要活性成分，筆者前期研究也報道了PD對白血病細(xì)胞K562的抑制作用[4]。國外研究發(fā)現(xiàn)其抑制白血病細(xì)胞的作用機制包括通過p21信號途徑下調(diào)weel和CDK2蛋白，抑制細(xì)胞核內(nèi)DNA復(fù)制和紡錘體形成，阻止有絲分裂[10]；降低c-Myc和SP1蛋白表達水平，下調(diào)其與DNA結(jié)合能力，抑制hTERT的磷酸化及核轉(zhuǎn)位發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的能力[11]；通過抑制Egr-1的活化、ROS的產(chǎn)生、MMP的分解誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，PD聯(lián)合IM組相對于空白對照組、單獨用藥組，細(xì)胞存活率明顯降低、凋亡率明顯增加，表明兩藥有協(xié)同效應(yīng)，PD增強IM對K562細(xì)胞抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，本實驗進一步明確了PD可以抑制融合基因Bcr/abl及其下游信號通路P13K/AKT/mTOR從而抑制白血病細(xì)胞的生長。

PIK/AKT/mTOR途徑是Bcr/abl融合基因下游的一條重要信號通路。融合基因Bcr/abl激酶可通過SH2結(jié)構(gòu)域與P13K的p85調(diào)節(jié)亞基相結(jié)合，導(dǎo)致P13K/Akt信號通路激活引起細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[1]。細(xì)胞啟動翻譯信號及細(xì)胞由G0/G1期進入S期必須通過mTOR信號通路，同時mTOR信號也能調(diào)節(jié)細(xì)胞的分解和合成代謝，與蛋白合成、細(xì)胞周期的調(diào)控相關(guān)[13]。P13K/Akt下游最重要的效應(yīng)分子是mTOR，mTOR磷酸化的水平在CML患者的骨髓細(xì)胞中明顯升高[14-15]，mTOR途徑呈現(xiàn)異常激活狀態(tài)，提示CML的發(fā)生與mTOR途徑的異常激活有關(guān)[16]。研究表明當(dāng)小鼠造血干細(xì)胞中P13K/AKT/ mTOR途徑被激活后，干細(xì)胞更容易向白血病性轉(zhuǎn)化[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)PD聯(lián)合IM在抑制Bcr/abl融合蛋白表達、抑制PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)方面均明顯優(yōu)于單藥，表明PD增強IM抗K562細(xì)胞作用，對CML的治療可以在應(yīng)用IM作為一線治療藥物的同時嘗試聯(lián)合應(yīng)用PD，以減少CML患者對IM的耐藥性，為白血病的基因治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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（本文編輯：馬雯娜）

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本刊編輯部

Effect of platycodin D combined with imatinib on K562 cell in vitro

DAI Qun,GE Yuqing.Central Laboratory of First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou310006,China

Objective To investig ate the effectand mechanism of Platycodin(PD)comb ined with imatinib(IM)on chronic myelogenous leukemia K562 cells in vitro. Methods Cultured K562 cells were treated with PD and imatinib alone or in comb ination.Cell proliferation was examined b y CCK8 assay.Cell ap optosis were d etected b y Annexin V FITC/PI d oub le staining.The chang e of mitochond rial trans-memb rane p otential was measured b y JC-1 staining.The p rotein exp ression of cleaved casp ase-3,cleaved casp ase-9,PARP,cleaved PARP,Bcr/ab l,p-AKT and p-mTOR were d etected b y Western b lot. Results The inhib itory effects of PD comb ined with imatinib on p roliferation and ap op tosis of K562 cells were sig nificantly hig her than those of the controlg roup or sing le d rug g roup s(all P＜0.01).The exp ression of cleaved casp ase-3,cleaved casp ase-9 and cleaved PARP p roteins was sig nificantly up-reg ulated in the comb ination g roup,and the exp ression of PARP,Bcr/ab l, p-AKT and p-mTOR p roteins was sig nificantly d own-reg ulated(P＜0.01 or 0.05). Conclusion Platycod in D comb ined with imatinib can sig nificantly increase the inhib itory effect on cell p roliferation and ind uce ap op tosis of K562 cells comp ared with sing le d rug s,which may b e related to Bcr/ab lp rotein and PI3K/AKT/mTOR sig naling p athway.

Platycod in D Imatinib K562 Bcr/ab lfusion g ene PI3K/AKT/mTOR sig nalp athway

2017-03-22）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.17.2017-622

國家自然科學(xué)基金自助項目（81673755）

310006杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室

葛宇清，E-mail：chengleiqing@163.com