重組 IL-4R蛋白對 SD大鼠過敏性哮喘干預作用的研究

楊光勇 郭海濤 劉茜明 劉莉莉 何光志

重組 IL-4R蛋白對 SD大鼠過敏性哮喘干預作用的研究

楊光勇 郭海濤 劉茜明 劉莉莉 何光志

目的 探索重組IL-4R蛋白對過敏性哮喘動物模型的干預作用。方法 選擇6周齡SD大鼠60只，采用安全隨機分組法分成哮喘模型組、IL-4R組、布地奈德組和對照組，每組15只。哮喘模型組在腹部選取3處于皮下注射10%雞卵清白蛋白（OVA）混合液1ml（OVA 100mg、氫氧化鋁100mg及滅活的百日咳桿菌5×109個）進行致敏，1周后用上述同樣藥物再進行致敏，第2次致敏1周后將大鼠分別放入不完全封閉的箱中，用5%OVA與0.9%氯化鈉混合溶液，連續10d超聲霧化激發30min。IL-4R組和布地奈德組同法造模，但每次霧化激發前30min，IL-4R組腹腔注射重組IL-4R蛋白稀釋液（400μg/d）。布地奈德組腹腔注射布地奈德稀釋液（400μg/d），對照組用0.9%氯化鈉溶液連續10d超聲霧化激發30min。取4組大鼠肺組織作HE染色的光鏡病理切片，觀察肺組織病理變化。建立間接ELISA方法，檢測實驗中4組大鼠肺泡灌洗液中的IL-4和IFN-γ的含量。結果 哮喘模型組大鼠肺組織有大量嗜酸性粒細胞浸潤，對照組大鼠肺組織幾乎無嗜酸性粒細胞浸潤，IL-4R組和布地奈德組大鼠肺組織嗜酸性粒細胞浸潤明顯少于哮喘模型組。IL-4R組和布地奈德組肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ的含量明顯高于哮喘模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結論 研究結果提示IL-4R蛋白對過敏性哮喘有良好的干預作用。

IL-4R IFN-γ ELISA 過敏性哮喘

過敏性哮喘占所有哮喘患者的70%，其發病機制尚不完全清楚。目前認為過敏性哮喘主要是由多種炎癥細胞如嗜酸性粒細胞、肥大細胞和淋巴細胞等細胞因子共同參與，導致慢性過敏性氣道炎癥性疾病，而IL-4和IFN-γ等細胞因子在過敏性哮喘發生、發展中起著十分重要的作用[1]。IL-4受體（IL-4R）與IL-4特異性結合后可使IL-4無法發揮其生物學效應，通過抑制IL-4和IL-4R抗體（IL-4Rα）對過敏性哮喘起到有效地免疫調節作用[2-3]，并有望成為治療過敏性哮喘的有效途徑。本研究使用重組IL-4R蛋白干預過敏性哮喘SD大鼠動物模型并檢測肺泡灌洗液中的IL-4和IFN-γ的含量，探索重組IL-4R蛋白對過敏性哮喘動物模型的干預作用，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 6周齡SD大鼠60只，雌雄各30只，購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司（批號：500903559023203）；重組IL-4R蛋白（批號：LC08AP1102）購自北京義翹神州生物技術有限公司；大鼠IL-4 ELISA Kit（批號：20130013）購自杭州聯科生物技術有限公司；大鼠IFN-γELISA Kit（批號：20130013），杭州聯科生物技術有限公司；滅活的百日咳桿菌原液，北京天壇生物制品股份有限公司；雷諾考特（布地奈德鼻噴霧劑，批號：國藥準字J20090079，瑞典阿斯利康公司）；抗IL-4陽性標準樣本和陰性標準樣本、抗IFN-γ陽性標準樣本和陰性標準樣本各1份均由實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠建模與分組參考文獻[4]，采用安全隨機分組法分成哮喘模型組、IL-4R組、布地奈德組和對照組，每組15只。哮喘模型組在腹部選取3處于皮下注射10%的雞卵清白蛋白（OVA）混合液1ml（OVA 100mg、氫氧化鋁100mg及滅活的百日咳桿菌5×109個）進行致敏，1周后用上述同樣藥物再進行致敏，第2次致敏1周后將大鼠分別放入不完全封閉的箱中，用5%OVA與0.9%氯化鈉溶液混合，連續10d超聲霧化激發30min。IL-4R組和布地奈德組與哮喘模型組造模方法處理一致，但每次霧化激發前30min，給IL-4R組大鼠腹腔注射治療劑量的重組IL-4R蛋白稀釋液（400μg/d）[5]，布地奈德組大鼠腹腔注射治療劑量的布地奈德稀釋液（400μg/d），對照組用0.9%氯化鈉溶液連續10d超聲霧化激發30min。觀察4組大鼠臨床癥狀和體征。

1.2.2 大鼠肺泡灌洗液收集及肺組織病理檢查收集 4組大鼠最后一次激發后的肺泡灌洗液，將其于4℃環境下離心（1 500r/min）10min，收集離心后的上清液，于4℃環境下保存備用。在用藥結束后，采用股動脈放血法處死大鼠。取右肺中下葉和副葉，以4%甲醛溶液固定制成標本，并作病理切片（HE染色），在顯微鏡下觀察。

1.2.3 大鼠肺泡灌洗液中的IL-4和IFN-γ含量檢測 （1）測定標準品IL-4和IFN-γ濃度梯度及肺泡灌洗液最佳稀釋倍數：按大鼠IL-4 ELISA Kit和大鼠IFN-γELISA Kit試劑盒說明書操作，分別測定最佳稀釋倍數，以抗IL-4陰性標準品和陽性標準品濃度/梯度（P/N）范圍的OD450比值所對應的最大稀釋倍數作為判斷標準。（2）間接ELISA法檢測OD450值：參考ELISA試劑盒說明書操作，建立檢測IL-4和IFN-γ的OD450值。（3）測定IL-4和IFN-γ酶標二抗最佳工作濃度：酶標二抗按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32作倍比稀釋，檢測已知IL-4陰性標準品和陽性標準品，進而確定酶標二抗的最佳工作濃度。IFN-γ的酶標二抗最佳工作濃度的確定方法同IL-4。（4）IL-4和IFN-γ陰陽臨界值的確定：另選擇5份同批次正常SD大鼠肺泡灌洗液進行ELISA檢測。按照ELISA Kit試劑盒說明書設置IL-4和IFN-γ的陽性標準品和陰性標準品。計算出本批次SD的大鼠OD450的均數（） 和標準差（s），按±3s公式計算陰陽臨界值。（5）特異度實驗：本次試驗建立IFN-γ間接ELISA方法的特異度驗證，通過試劑盒中的IgE、IL-4標準陽性樣品來鑒定；采用試劑盒中的IgE、IFN-γ標準陽性品鑒定本次實驗建立IL-4間接ELISA方法的特異度。（6）IL-4和IFN-γ檢測：采用以上各組檢測結果最終計算出4組樣本肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ的含量。

1.3 統計學處理 應用SPSS 21.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠肺組織病理檢查 見圖1。

圖1 4組大鼠肺組織HE染色病理切片（a：對照組大鼠肺泡大小正常，未見炎性細胞浸潤；b：哮喘模型組出現區域間質水腫，存在數量多范圍廣的嗜酸性粒細胞、漿細胞和單核細胞等炎性細胞浸潤；c：IL-4R組觀察到肺泡變得大小不等，肺泡隔增寬，炎性細胞分布以血管周較多，其余區域較少；d：布地奈德組炎性細胞以血管周圍分布較多，其余區域較少，HE染色，×200）

由圖1可見，哮喘模型組大鼠肺組織有大量嗜酸性粒細胞浸潤，對照組大鼠肺組織幾乎無嗜酸性粒細胞浸潤，IL-4R組和布地奈德組大鼠的肺組織嗜酸性粒細胞浸潤明顯少于哮喘模型組。

2.2 IL-4、IFN-γ抗體標準品梯度、肺灌洗液最佳稀釋倍數及酶標二抗最佳工作濃度的確定（OD450值） 見表1。

表1 IL-4、IFN-γ抗體標準品梯度、肺灌洗液最佳稀釋倍數及酶標二抗最佳工作濃度測定結果（OD450值）

由表1可見，肺灌洗液稀釋倍數、抗IL-4抗體標準品和抗IFN-γ陽性標準品均作1∶8倍稀釋為最佳工作濃度。在陰、陽性對照差異最大時，IL-4的酶標二抗的稀釋度即為最佳工作濃度，此時IL-4酶標二抗1∶4的稀釋濃度為最佳工作濃度；而IFN-γ酶標二抗最佳工作濃度為1∶8的稀釋濃度為最佳工作濃度。

2.3 IL-4和IFN-γ陰陽臨界值確定（OD450值） 見表2。

表2 IL-4和IFN-γ陰陽臨界值確定（OD450值）

由表2可見，各組OD450值按x±3s公式計算出IL-4臨界值為0.236，IFN-γ陰陽臨界值為0.166。

2.4 特異度實驗結果 采用含有IgE、IL-4的標準陽性樣品對IFN-γ進行特異度驗證，其結果全為陰性；采用含有IgE、IFN-γ的標準陽性樣品對IL-4進行特異度驗證，其結果全為陰性。說明本次試驗建立的ELISA方法具有較強的特異度。

2.5 4組大鼠肺泡灌洗液中細胞因子IL-4和IFN-γ的ELISA檢測（OD450值） 見表3。

表3 4組大鼠肺泡灌洗液中細胞因子IL-4和IFN-γ的ELISA檢測（OD450值）

由表3可見，哮喘模型組細胞因子IL-4高于對照組，IFN-γ低于對照組，IL-4R組、布地奈德組IL-4低于哮喘模型組，IFN-γ高于哮喘模型組，差異均有統計學意義（F=37.594、33.89，均P＜0.05）。

3 討論

IFN-γ是一種Th1細胞分泌的活性糖蛋白，具有免疫調節作用，并能增強抗病毒能力。IFN-γ可以抑制IL-4的合成及IL-4誘導的免疫球蛋白轉換和Th2細胞的增殖，從而抑制IgE的產生[6-7]。Th細胞包括Th1和Th2，是過敏性哮喘關鍵的效應細胞。Th2分泌IL-13和IL-4等細胞因子能促進IgE的合成，引起哮喘的發生、發展，因而抑制IL-13和IL-4的分泌或作用可以治療哮喘[8]。在過敏性哮喘急性發作期Th2細胞功能亢進，Th1細胞功能低下，使得IgE大量產生從而導致肥大細胞釋放嗜酸性粒細胞趨化因子和血小板活化因子等，這些因子能引起支氣管平滑肌痙攣和黏膜水腫等使得支氣管腔狹窄、氣流受限，從而加重哮喘癥狀[9]。臨床檢測也表明，患者體內嗜酸性粒細胞增加、IL-4水平升高、IFN-γ水平降低與兒童支氣管哮喘的發生與發展有密切關系[10]。

臨床研究發現，在使用雙抗體夾心酶聯免疫吸附實驗、布地奈德及多種中藥方劑等藥物治療后，外周血中IFN-γ/IL-4的比值升高的患者過敏性哮喘癥狀明顯改善[11-14]。如在過敏性哮喘豚鼠實驗中使用地氯雷他定顯著的改善了其肺組織的病理變化，明顯降低肺組織IL-4R mRNA表達水平從而抑制IL-4與IL-4R發揮正常作用，緩解哮喘癥狀[15]。國內外的學者們認為抑制IL-4與IL-4R結合使其不能發揮正常作用是緩解和治療哮喘的一種有效途徑[16-17]，因此IL-4與IL-4R的拮抗劑的開發研究成為目前的研究熱點之一[18]。可溶性重組IL-4R蛋白具有與IL-4結合的高度特異度和親和力，是IL-4R一種理想的拮抗劑。

本研究通過利用可溶性重組IL-4R蛋白作為IL-4R拮抗劑對大鼠過敏性哮喘模型進行干預實驗，IL-4R組大鼠在癥狀體征及肺組織病理觀察上明顯較哮喘模型組輕，且體內IL-4和IFN-γ含量與哮喘模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），研究結果表明重組IL-4R蛋白能降低過敏性哮喘動物模型肺灌洗液中IL-4，提高IFN-γ的含量，IFN-γ/IL-4比值升高。檢測結果顯示IFN-γ/IL-4比值升高，提示重組IL-4R蛋白能夠抑制大鼠過敏性哮喘的形成，明顯干預其發展。

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Intervention of allergic asthma with recombinant IL-4R in rats

YANG Guangyong,GUO Haitao,LIU Ximing,et al.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,China

Objective To investig ate the effectofrecomb inant IL-4R on allerg ic asthma in rats.Methods Sixty SD rats in 6 wk ofag e were rand omly d ivid ed into mod elg roup,IL-4R g roup,b ud esonid e g roup(as p ositive control)and controlg roup with 15 in each.Asthma mod elwas ind uced with sub cutaneous injection of ovalb umin(OVA).Rats in IL-4R g roup，b udesonide group and controlg roup were g iven intrap eritonealinjection of recomb inant IL-4R(400μg/d),b ud esonid e(400μg/d)or normalsaline, resp ectively.The p atholog ical chang es of lung tissues were ob served with HE staining,the contents of IL-4 and IFN-γ in alveolar lavag e fluid were d etected b y ind irect ELISA method. Results Larg e amount of eosinop hilinfiltration in the lung tissue was ob served in asthma mod elg roup,which were sig nificantly attenuated in IL-4R b ud esonid e g roup s.The contents of IL-4 and IFN-γin alveolar lavag efluid of IL-4R and b ud esonid e g roup s were sig nificantly lower than those of asthma mod elg roup(P＜0.05). Conclusion The results sug g estthatrecomb inant IL-4R can effectively intervene allerg ic asthma in rats.

IL-4R IFN-γ ELISA Allerg ic asthma

2015-11-13）

（本文編輯：楊麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.17.2015-1352

2011年貴州省社會發展科技攻關項目［黔科合SY字（2011）3020］、貴州省委組織部高層次人才科研條件特助經費（TZJF-2011年28號）

550025貴陽中醫學院基礎醫學院

何光志，E-mail：heguangzhi7711@sina.com