抗TSLP全人源單鏈抗體的體外親和力成熟①

先德群 年四季 葉迎春 徐文峰 袁 青

(西南醫科大學基礎醫學院，瀘州646000)

抗TSLP全人源單鏈抗體的體外親和力成熟①

先德群 年四季 葉迎春 徐文峰 袁 青②

(西南醫科大學基礎醫學院，瀘州646000)

目的：對抗TSLP-scFv全人源單鏈抗體進行單點突變，以提高其親和力。方法：本研究前期篩選了特異性好的抗TSLP-scFv，本研究利用Discovery Studio系統模擬TSLP和抗TSLP-scFv 三維結構，進行分子對接，對結合表位氨基酸進行隨機突變，選取可顯著提高其親和力的氨基酸突變點，根據突變位點設計引物，采用重疊延伸PCR對氨基酸位點進行突變。將突變后的scFv基因與表達載體pLZ16連接，轉化E.coli DH5αF′，表達后篩選親和力提高的抗TSLP-scFv。結果：DS系統篩選出可以提高scFv親和力的5個單點突變氨基酸位點，PCR擴增出突變后的抗TSLP-scFv DNA片段大小為1 000 bp左右。將測序正確的菌株進行表達，通過ELISA篩選出與抗原結合力提升的抗TSLP-scFv；通過生物大分子相互作用技術，測定單抗的親和力，突變后的scFv M4親和力較突變前提高了10倍左右。結論：成功提升了抗TSLP-scFv全人源單鏈抗體的親和力。

抗TSLP-scFv；全人源單鏈抗體；分子對接；親和力

胸腺基質淋巴細胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)是具有四螺旋束折疊結構的短鏈型細胞因子，與 IL-7類似，屬于IL-2細胞因子家族成員[1]。由Firend等[2]首次從胸腺基質細胞培養上清液中分離而得名。人TSLP基因位于染色體5q22.1，鄰近特應性細胞因子基因簇5q31，該基因簇主要編碼Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-9和IL-13[3]。在肺和皮膚的上皮細胞中發現了最高水平的TSLP，并且成纖維細胞、ASMC(氣道平滑肌細胞)、內皮細胞、肥大細胞、巨噬細胞/單核細胞、粒細胞和DC(樹突狀細胞)也能產生TSLP[4]。TSLP通過激活髓樣樹突狀細胞(mDC)，促進Th0細胞向Th2型細胞分化，產生大量的IL-4、IL-13、IL-5和TNF-α等Th2型細胞因子，從而導致過敏性炎癥的發生[5]。TSLP也能作用于CD4+T細胞和肥大細胞，增強Th2型炎癥反應[6,7]。最近的研究發現，TSLP與多種腫瘤也存在相關性。在乳腺癌、肺癌、皮膚T細胞淋巴瘤、急性B淋巴細胞性白血病(B-ALL)和宮頸癌等疾病中，TSLP表達量均上升[8-12]。

以上研究表明，針對TSLP和TSLPR信號通路，制備抗TSLP的中和性抗體，將會為多種疾病提供新的治療方法。本研究前期篩選了抗TSLP單鏈抗體，但其親和力不高。目前采用Discovery Studio (DS)系統對單鏈抗體進行單點突變以提高其親和力，并進行了實驗驗證，從而制備親和力高的抗TSLP全人源單鏈抗體。

1 材料與方法

1.1材料 引物由Invitrogen公司合成；pLZ16載體為PUC質粒改進后的載體；ExTaq酶、T4 DNA連接酶、NotⅠ和NcoⅠ限制性內切酶購自TaKaRa公司；DNA marker標準分子量1 000 bp、2 000 bp購自TaKaRa公司；高純度質粒小提試劑盒購自康為世紀公司；標準蛋白rHuTSLP、E.coli DH5αF′購自Gene公司。

1.2方法

1.2.1抗TSLP全人源單鏈抗體基因突變點的選定 將本研究前期篩選得到的抗TSLP全人源單鏈抗體序列與TSLP抗原序列輸入DS軟件系統，與NCBI晶體庫模型比對，選擇與目標序列相似度最高的晶體結構，進行同源建模。將抗TSLP-scFv作為受體、TSLP作為配體，通過ZDOCK軟件程序對蛋白分子進行柔性對接，然后使用RDOCK將對接結果優化。通過計算分析抗原-抗體結合表位，選取24個關鍵氨基酸進行飽和突變，最終選擇5個可以提高抗體親和力的氨基酸進行單點突變。

1.2.2抗TSLP突變基因的擴增 根據選定的5個突變位點，利用重疊延伸PCR原理分別設計引物(表1)，送至Invitrogen公司合成，分別對突變點M1、M2、M3、M4、M5進行突變。以前期篩選的含抗TSLP單鏈抗體基因的質粒為模板，每個突變位點的引物相互配對，分別進行PCR擴增。擴增程序為94℃ 2 min， 98℃ 30 s，55℃ 30 s， 72℃ 1 min，32次循環，最后72℃延伸10 min。將擴增后每個位點前、后兩部分產物分別配對，按94℃ 2 min，98℃ 30 s，60℃ 30 s， 72℃ 1 min，10次循環， 72℃延伸10 min 擴增后，加入上游引物scFv84F-TSLP，下游引物KM168，再按以上程序擴增20個循環，得到5個突變后的抗TSLP-scFv PCR產物。

1.2.3突變后單鏈抗體的克隆和表達 將突變后的單鏈抗體PCR產物與表達載體pLZ16(含FLAG和His-tag標簽)分別進行NotⅠ和NocⅠ雙酶切，使用T4 DNA連接酶連接后轉入DH5αF′感受肽中。將測序正確的陽性克隆子與突變前的scFv菌株過夜培養后，取5 ml 接種到100 ml LBA (含終濃度為100 μg/ml氨芐青霉素)的培養基中，37℃，200 r/min培養至OD600=0.6 左右，加入終濃度為1 mmol/L IPTG 于32℃誘導表達5 h 。收集沉淀，使用1×PBS重懸沉淀后，于冰上超聲破碎細菌，離心收集上清用于檢測。

1.2.4ELISA檢測單鏈抗體的表達水平 用包被液50 μl+單鏈抗體(scFv-TSLP和M4)上清50 μl混勻后包被酶標孔，37℃包被2 h。加封閉液(1×PBST 含5% 脫脂奶粉)37℃封閉1 h后，加入Anti-Flag-HRP， 37℃保溫濕育1 h。洗滌后用TMB顯色液室溫避光顯色30 min，于OD450處讀取吸光值。

1.2.5間接ELISA檢測單鏈抗體 采用包被液(0.1 mol/L NaHCO3/Na2CO3溶液，pH9.6)稀釋TSLP純化蛋至終濃度為50 g/ml，于4℃過夜包被酶標孔，加入封閉液( 1 × PBST 含5% 脫脂奶粉) 于37℃封閉酶標孔1 h后，加入單鏈抗體表達上清(上清預先用封閉液分別稀釋1×、10×、100×)，37℃保濕孵育1 h，洗滌后加入用封閉液稀釋4 000×的Anti-Flag-HRP，37℃孵育1 h。洗滌后加入TMB底物顯色液，室溫避光顯色30 min，OD450處讀取吸光值。以突變前的抗TSLP-scFv作為陽性對照，比較吸光值的差異。

1.2.6生物大分子相互作用測定單鏈抗體的親和力 取突變后的單鏈抗體M4裂解上清液4 μl，偶聯至生物傳感器(anti-Flag)。再取不同濃度(20、40、80 μg/ml)的標準rHuTSLP蛋白各4 μl，依次與傳感器相互作用。通過系統分析抗原抗體的結合與解離過程，計算出親和力KD值，以測定單鏈抗體的親和力。

表1單鏈抗體單點突變引物的設計

Tab.1DesignofprimersforsingleaminoacidmutationofscFv

2 結果

2.1通過DS軟件系統選定單點突變位點

2.1.1抗原、抗體同源模型的建立 利用DS軟件系統對TSLP抗原和scFv-TSLP抗體進行同源建模，考慮溶劑效應，并選擇合適的分子力場，對TSLP和scFv-TSLP進行結構優化，得到穩定的骨架式三維構象(圖1)。其中圖1A是scFv-TSLP的全景圖，圖1B是TSLP的局部圖。

2.1.2抗原、抗體的分子對接 將抗TSLP-scFv作為受體、TSLP作為配體，通過ZDOCK進行分子對接。在對接計算過程中，允許配體和受體的構象發生自由變化，使得到的對接結果精度較高，并使用RDCOK將對接結果進行優化。圖2A是抗原-抗體結合的穩定復合物飄帶模型，左側是TSLP的4個螺旋結構，右側是scFv的輕鏈和重鏈。

2.1.3分析抗原-抗體結合表面及選擇氨基酸突變點 通過計算抗原-抗體結合表位，對結合內表面進行分析，選取24個關鍵氨基酸進行飽和突變。在考慮溫度、pH值等條件下，計算每個氨基酸的突變能量及穩定性。最終選擇5個突變后能量負值較大且穩定性較高的氨基酸進行單點突變(表2)。圖2B是抗原抗體結合活性部位的全景圖。圖2C是結合表面的局部放大圖，其中THR、SER、GLY是需突變的位點。

圖1 TSLP抗原與抗TSLP單鏈抗體的同源建模Fig.1 Homology modeling of TSLP and anti-TSLP scFvNote: A.The three-dimensional structure of scFv against TSLP；B.The three-dimensional structure of TSLP(red-O，yellow-S，gray-C，blue-N，white-H).

2.2重疊延伸PCR對突變點進行單點突變 根據重疊延伸PCR原理，使每個突變點的引物配對，擴增出每個突變點的前(a)、后(b)段基因，并將前后段基因進行連接，連接后的目的基因大小約為1 000 bp(圖3A、B)。

2.3單鏈抗體的表達和ELISA檢測 將5個突變單鏈抗體(M1、M2、M3、M4、M5 )PCR產物與表達載體pLZ16連接后，經生物公司測序和NCBI BLAST比對，發現突變單鏈抗體M1、M2、M4、M5序列正確，M3含有終止密碼子。因pLZ16表達載體含有抗氨芐青霉素基因，所以使用氨芐青霉素作為抗性篩選以表達目的蛋白。同時該融合表達載體含有Flag標簽，所以使用HRP標記的Anti-Flag單克隆抗體進行ELISA檢測。間接ELISA篩選出突變單鏈抗體M4，結合抗原的能力較突變前明顯上升(圖4A)。

圖2 抗原抗體結合表面分析及單鏈抗體氨基酸位點的虛擬突變Fig.2 Analysis of antigen-antibody binding surface and virtual mutation of key amino acid of scFvNote: A.Molecular docking of TSLP and anti-TSLP-scFv； B.Analysis of antigen-antibody binding surface；C.Virtual mutation of key amino acid of scFv.

表2突變后能提高親和力的氨基酸

Tab.2MutatedaminoacidswhichcouldimproveaffinityofscFv

PremutatedaminoacidMutatedaminoacidMutatedbasesequenceM1:THR(165)PHETTT/TTCM2:SER(167)ARGCGT/CGC/CGG/CGAM3:SER(167)PHETTT/TTCM4:SER(167)HISCAT/CACM5:GLY(230)TRPTGG

圖3 PCR擴增突變單鏈抗體基因Fig.3 Amplification of mutated scFvs by PCRNote: A .Amplification of front part (a) and latter part (b) containing mutated amino acid of scFv by PCR；B. Link of the front part and latter part containing mutated amino acid by overlapping extension PCR.

圖4 ELISA檢測表達的抗TSLP單鏈抗體Fig.4 Detection of scFvs against TSLP by ELISANote: A.Indirect ELISA detection of the binding of scFvs with TSLP by coating TSLP antigen in the plate wells(scFv-TSLP was not mutated, M1/M2/M4/M5 were mutated)；B.ELISA detection of the expression level of non-mutated scFv and mutated scFv M4 by coating the expressed scFv directly in the plate wells；C.Indirect ELISA detection of the binding of non-mutated scFv and mutated scFv M4 with TLSP by coating the TSLP antigen in the ELISA plate wells.

ELISA檢測單鏈抗體表達水平時，突變單鏈抗體M4雖然其表達水平比突變前低(圖4B)，但間接ELISA結果顯示其結合TSLP抗原蛋白的能力卻比突變前高(圖4C)，說明突變單鏈抗體M4較突變前其親和力得到了提高。

2.4BIAcore技術測定單鏈抗體的親和力 為進一步驗證突變單鏈抗體M4其親和力較突變前提高了，我們使用Anti-Flag生物傳感器捕獲M4后，與不同濃度的標準rHuTSLP抗原蛋白相互作用，得到反應曲線。通過分析其結合與解離過程，計算出突變單鏈抗體M4的親和力KD值為3.089e-8，較突變前提高了10倍左右。

3 討論

TSLP是一種上皮細胞來源的細胞因子，廣泛表達于多種細胞和組織，其中以肺和皮膚的上皮細胞中表達量最高[4]。TSLP結合其高親和力的異質二聚體受體復合物，該受體復合物包括TSLPR和IL-7Rα兩個亞基。TSLPR在多種類型的細胞上表達，包括骨髓樹突狀細胞(mDC)、CD4+和CD8+T細胞、Treg細胞、B細胞、肥大細胞、NK細胞、單核細胞、CD34+祖細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞、氣道平滑肌和氣道上皮細胞等[4,13]。越來越多的研究證實，TSLP與多種臨床疾病密切相關。其中包括變應性疾病中的特異性皮炎、變應性鼻炎和過敏性哮喘[14-16]。也包括自身免疫性疾病，如類風濕性關節炎、炎性腸病等[17，18]。還包括多種腫瘤性疾病，如乳腺癌、肺癌、皮膚T細胞淋巴瘤、B-ALL和宮頸癌等[8-12]。另有研究證實，在重癥肌無力(MG)和原因不明的復發性流產患者中，TSLP表達量較正常人明顯降低[12,19]。最近有研究表明，在哮喘患者中，使用抗TSLP單克隆抗體治療，不改變外周血中Treg細胞的比例[20]。以上結果強烈支持，針對TSLP制備中和性單克隆抗體，將具有廣泛的臨床應用潛力。但需要對TSLP及其受體TSLPR的生物學功能作進一步的研究，以確定抗TSLP單克隆抗體的適應證及禁忌證。

本研究前期已從噬菌體文庫中篩選出抗TSLP全人源單鏈抗體，該單鏈抗體具有特異性強、體外中和TSLP等特點[21]。但通過噬菌體展示技術制備的單鏈抗體親和力較低。本實驗通過ZDOCK計算機技術，模擬分子對接，選取突變位點，進行實驗突變，最終突變后的單鏈抗體M4親和力較突變前提高了約10倍左右。以上結果表明，通過DS軟件系統模擬分子對接，設計突變位點，能有效提高抗體的親和力，并較單純地實驗尋找突變位點更省時、更經濟。但是，本實驗中抗體親和力的提升不是特別顯著，可能與計算機技術不能完全模擬實驗時的各種條件(如:溫度、濕度、pH、溶液環境等)有關。另外，單鏈抗體具有半衰期短，易形成二聚體失活等缺點。本實驗后期，擬將親和力提高的單鏈抗體基因重組到真核表達載體，構建真核表達系統。為后期的體外生物學功能實驗、動物實驗和臨床應用奠定基礎。

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[收稿2017-03-07 修回2017-04-14]

(編輯 張曉舟)

AffinitymaturationofhumanscFvanti-TSLPinvitro

XIANDe-Qun,NIANSi-Ji,YEYing-Chun,XUWen-Feng,YUANQing.

TheSchoolofBasicMedicalScience,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China

Objective:To single amino acid mutation of the full human scFvs against TSLP to enhance its affinity.Methods: The specific scFvs against TSLP was screened in our previous study and here the three-dimensional structures of TSLP and anti-TSLP scFvs were simulated by Discovery Studio system,then the molecular docking was made.The amino acids of binding epitope were randomly mutated and the mutated amino acids were selected which could remarkably improve the affinity of scFvs.The primers were designed based on the sequence of mutation amino acids and the scFv sequences were mutated by the overlapping extension PCR.The DNA of mutated scFvs was ligated with the expression vector pLZ16 and transformed into E.coli DH5αF′.Then the scFvs were expressed and the scFvs with improved affinity were selected by ELISA and BIAcore.Results: The five scFvs with single amino acid mutation were screened out by DS system,which could elevate the affinity of scFvs.The mutated anti-TSLP-scFvs were amplified by PCR,which size was about 1 000 bp.The mutated scFvs with correct sequence were expressed,and the mutated scFvs with improved affinity were detected by ELISA and BIAcore.The affinity of selected mutated scFv (M4) has been about 10 times higher than the scFv nonmutation.Conclusion: The affinity of anti-TSLP-scFv has been improved successfully.

Anti-TSLP-scFv；Full human scFv；Molecular docking；Affinity

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.005

先德群(1983年-)，女，碩士,主治醫師，主要從事重組抗體研究。

及指導教師：袁 青(1978年-),女,博士，教授,博士生導師，主要從事重組抗體研究,Email:yuanqing_ok@hotmail.com。

R392.11R786

A

1000-484X(2017)09-1301-05

①本文為四川省科技廳項目(2015JY0218,LY-96)和四川省教育廳項目(16TD0022,17ZB0487)。

②西南醫科大學藥學院藥理學教研室，瀘州646000。