miR-218調控SNX4蛋白對乳腺癌細胞增殖和侵襲的影響①

張建波 宋 魏 王媛媛 劉明閣 孫淼淼

(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科，鄭州450008)

·生物治療·

miR-218調控SNX4蛋白對乳腺癌細胞增殖和侵襲的影響①

張建波 宋 魏 王媛媛 劉明閣 孫淼淼

(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科，鄭州450008)

目的：探討miR-218調控SNX4蛋白對乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響。方法：qPCR檢測乳腺癌組織和乳腺癌細胞株中miR-218的表達情況；分析miR-218的表達和乳腺癌臨床病理參數之間的關系；雙熒光素酶實驗檢測miR-218和SNX4之間的關系；過表達miR-218后MTT實驗和侵襲實驗檢測乳腺癌細胞增殖和侵襲能力變化；過表達SNX4后MTT實驗和侵襲實驗檢測SNX4對乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的恢復水平；裸鼠體外成瘤實驗檢測miR-218對乳腺癌細胞株成瘤能力的影響。結果：miR-218在乳腺癌組織和MCF-7細胞株中表達水平較高，miR-218的表達與乳腺癌的病理分期相關以及淋巴結轉移情況有關， SNX4可能是miR-218下游的作用靶點；過表達miR-21可以抑制乳腺癌細胞的增殖侵襲能力，過表達SNX4后可以逆轉miR-218對乳腺癌細胞的抑制作用，過表達miR-218后可以抑制乳腺癌細胞株在裸鼠體內的成瘤能力。結論：miR-218在乳腺癌中表達上調，同時miR-218可以調控SNX4的表達而影響乳腺癌細胞增殖和侵襲能力。

乳腺癌；miR-218；SNX4；侵襲

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于卵巢癌和宮頸癌[1]。乳腺癌也是女性死于癌癥的第二大原因，僅次于肺癌[2]。乳腺癌根據基因表達可分為兩類：一類乳腺癌是過表達人類表皮生長因子受體2(HER2/ErbB2)，一類是HER2/ErbB2表達陰性，前者的預后相比后者較好[3]。而目前研究探明乳腺腫瘤包含癌細胞和癌細胞相通的基質細胞，如免疫、間充質和血管細胞，癌細胞和其基質細胞之間的聯系是由生長因子、細胞因子、蛋白酶和細胞外基質蛋白等介質介導的[4]。這些細胞外因子與基質細胞一起構成腫瘤微環(huán)境。然而，目前還不清楚這些因子對乳腺癌發(fā)生和發(fā)展進程中的具體作用，所以探討乳腺癌新的分子生物學靶標是目前的研究重點。

目前分子生物學的進展對乳腺癌的早期診斷和治療已經提供了很大的幫助。然而，對于晚期廣泛侵襲和轉移的乳腺癌的治療仍然效果不佳[5]。針對乳腺癌細胞的轉移機制還沒有完全闡明。最近很多研究都表明，微核糖核酸(microRNAs或miRNAs)涉及多種類型腫瘤的轉移和侵襲過程，包括miR-10b、miR-21、miR-126、miR-335、miR-373、miR146、miR-218和miR-205[6]。其中miR-224和miR-21和前列腺癌相關[7]。miR-29c和鼻咽癌相關[8]。 miR-10a、miR-222、miR-125b、miR-7和miR-452和膀胱上皮癌相關[9]。然而，目前報道的參與乳腺癌轉移的miRNA相對較少。

Sorting nexins (SNXs) 是一類含有PX結構域的分子蛋白，在細胞內蛋白分選和蛋白運輸等過程中發(fā)揮關鍵作用[10]。PX結構可以與磷脂酰肌醇集團特異性結合，并影響相關細胞器的活性[11]。根據結構域組成，目前在哺乳動物中發(fā)現有33種SNXs，包括SNX3、SNX4、SNX10、SNX12、SNX22和SNX-PX-BAR等[12]。在SNXs家族蛋白中，SNX-PX-BAR的功能研究報道較多，可以調控在細胞體內分選運輸過程。SNX4參與調節(jié)轉鐵蛋白受體的循環(huán)轉運過程[13]。最近，有學者研究SNX4對肝細胞的生物學功能的影響，發(fā)現過表達SNX4狀態(tài)可以對抗肝臟細胞中抗凋亡蛋白的表達。

本文實驗通過檢測miR-218和SNX4在乳腺癌細胞中的表達及相關作用，根據細胞生物學行為實驗，推測miR-218對乳腺癌細胞的影響情況及和SNX4的相關機制，為乳腺癌的發(fā)展過程中的分子機制提出新的可能。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株和裸鼠標本 人類乳腺癌細胞MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDA-MB-231、SKBR3、MCF-7購自上海細胞庫。細胞飼養(yǎng)條件：10%胎牛血清，100 U/ml青霉素鈉和100 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，Carlsbad，CA，USA)，在含有5%CO2的37℃恒溫箱中孵育。所有患者樣本均獲得書面知情同意書。動物實驗經動物研究機構委員會批準并符合國家實驗動物護理和使用指南。

1.1.2抗體和試劑 SNX4兔單克隆抗體均購自Abcam(ab118556)。Transwell小室購自美國Millipore公司。Matrigel購自美國BD公司。SNX4沉默及對照慢病毒購自上海吉凱制藥技術有限公司。qPCR引物以及RNA提取試劑盒、PCR試劑盒均購自廣州復能基因有限公司。miR-218-mimic購自上海吉凱制藥技術有限公司。Transwell小室購自美國Millipore公司。PCR試劑盒均購自廣州復能基因有限公司。

1.2方法

1.2.1雙熒光素酶報告基因 為進一步確證miR-218能夠靶向作用于SNX4。本實驗將SNX4的3′UTR區(qū)構建入熒光素酶報告基因載體。本次所用的雙熒光素酶報告基因實驗的載體包含兩個熒光素酶報告基因：一個是海腎熒光素酶報告基因，一個是熒火蟲熒光素酶報告基因，后者作為內對照。將上述基因的3′UTR構建到海腎熒光素酶報告基因的直接下游區(qū)，如果3′UTR能夠被miR-218識別，則該3′UTR前面的基因Luciferase的表達將被抑制，所以它與內參之間的比例會發(fā)生變化。

1.2.2MTT增殖實驗 體外增殖實驗測定使用24孔板(8 mm孔徑)測量乳腺癌細胞系的增殖能力。 將對數期乳腺癌細胞使用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸浮液并以1×103細胞/孔的密度接種到24孔板中。 在細胞培養(yǎng)7 d后，加入20 μl MTT測定液，每孔充分混合均勻，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在24、48、72和96 h MTT測定波長為490 nm時的吸光度，計算乳腺癌細胞的增殖情況。實驗重復3次。

1.2.3Transwell侵襲實驗 所有試劑及器材均于冰上預冷，將Transwell小室置于24孔板內，將Transwell小室內膜均勻涂抹Matrigel膠 50 μl (0.2 μg/μl)，37孵育15 min，至膠凝固后，消化、離心、計數卵巢癌細胞后，按照2.5×104ml-1用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞，制成細胞懸液；按照每孔200 μl，將細胞懸液加入Transwell上室，同時在Transwell下室加入10%FBS+培養(yǎng)基500 μl，放入37℃孵箱培養(yǎng)；甲醛固定，結晶紫染色10 min，然后用棉簽輕輕擦拭內膜上的細胞。顯微鏡下計數，計數4個高倍視野(×40)下穿過濾膜的細胞數。實驗重復3次。

1.2.4裸鼠體內實驗 取對數期生長的乳腺癌細胞，分為兩組。消化后重懸待用，調整為細胞濃度為2×107ml-1。取0.1 ml細胞懸液注射于每只裸鼠腹腔中，每組5只。之后每日觀察裸鼠皮下腫瘤生長情況。接種2周后，肉眼可見腫瘤生長。隔天測量各組荷瘤小鼠腫瘤直徑(a)和垂直正交徑(b)。6周后處死裸鼠，剝除瘤體測量并計算。

1.3統計學分析 統計分析均采用SPSS 16.0軟件包進行。用Student′st檢驗或χ2檢驗確定差異的統計學意義嗎，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1miR-218在乳腺癌組織和細胞中的表達情況 使用qPCR檢測70例乳腺癌患者和鄰近正常乳腺組織中miR-218的表達情況。 結果表明(圖1A)，與相鄰正常乳腺組織相比，miR-218的表達在乳腺癌組織中明顯下調。在不同乳腺癌細胞株中，與MDA-MB-468、MDA-MB-435、SKBR3、MDA-MB-231相比，MCF-7細胞株中觀察到miR-218表達相對較低，而且MCF-7的侵襲性相對較強(圖1B)。因此，我們選擇了MCF-7細胞株進行后續(xù)研究。

2.2miR-218與乳腺癌標本臨床病理參數之間的關系 為了證實miR-218在乳腺癌組織標本中的表達與其病理參數之間關系。70例乳腺癌腫瘤組織樣本類型為導管內癌(55例)、小葉原位癌(10例)，乳頭狀癌(5例)。在不同病理類型的乳腺癌之間的表達差異不明顯，無統計學意義(P>0.05)。miR-218的表達與年齡、無明顯統計學差異(P>0.05，表1)。miR-218的表達與乳腺癌的病理分期以及淋巴結轉移情況有關，隨著分期越低，miR-218在乳腺癌組織中表達也越高(P<0.05，表1)。

圖1 miR-218在乳腺癌組織和細胞中的表達情況Fig.1 Expression of miR-218 in breast cancer tissues and cell lines

表1miR-218表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

Tab.1miR-218expressionandrelationshipbetweenclinicopathologicalfeaturesofbreastcancer

Clinicopathol-ogicaldataNumberHighexpressionofmiR-218LowexpressionofmiR-218PvalueYears0.669≤6039211860312011Pathologicalstaging0.010Ⅰ15312Ⅱ1266Ⅲ37928Ⅳ615Lymphnodemetastasis0.008No451233Yes25718

2.3miR-218與SNX4之間的相關關聯 為了尋找miR-218的下游靶點，我們利用生物信息學分析，發(fā)現miR-218的序列與下游SNX4基因的部分序列有相同的結合位點。為了驗證二者之間是否有調節(jié)關系，我們進行雙熒光素酶標記實驗。首先我們構建了SNX4攜帶3′-UTR的熒光素酶報告因子，其中每個基因的結合位點與miR-218結合位點相對應。雙熒光素酶實驗測定顯示miR-218可以與下游SNX4的3′UTR位點相結合，而不是其他靶點基因，沉默miR-218后可以導致SNX4的熒光素酶活性顯著降低(圖2B)。沉默miR-218后可明顯下調MCF-7細胞中SNX4的表達。上述結果表明miR-218可以調控下游SNX4蛋白表達情況，可能是通過調控SNX4的表達影響乳腺癌細胞株的生物學行為。

2.4miR-218對乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響 為了研究miR-218對乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響，使用MCF-7細胞株進行質粒轉染以增加miR-218的表達。通過MTT實驗檢測miR-218對MCF-7細胞增殖情況的影響。miR-218-mimic組的細胞的生長速度比對照組明顯降低[(23.4±2.2)% vs (86.45±5.1)%,P<0.01]，培養(yǎng)96 h后抑制效果顯示具有統計學意義。如圖3所示，Transwell侵襲實驗檢測miR-218對MCF-7細胞侵襲情況的影響。miR-218-mimic組的細胞的侵襲細胞數目比對照組明顯增多[(186.5±15.1)% vs(48.4±4.2)%,P<0.01]，差異具有統計學意義(圖3，P<0.05)。綜上所述，過表達miR-218后可以明顯抑制MCF-7乳腺細胞株的增殖和侵襲能力。

圖2 雙熒光素酶實驗檢測miR-218與SNX4之間的相關關聯Fig.2 Double luciferase assay to detect association between miR-218 and SNX4Note: *.P<0.05.

圖3 miR-218對乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響Fig.3 Effects of miR-218 on proliferation and invasion of breast cancer cellsNote: A.MTT assay for the effect of miR-218 on proliferation of breast cancer cells；B.Transwell migration and invasion assay were used to detect the effect of miR-218 on the invasive ability of breast cancer cells.*.P<0.05.

圖4 SNX4和miR-218對乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的影響Fig.4 Effects of SNX4 and miR-218 on proliferation and invasion of breast cancer cellsNote: A.Effect of MTT assay on the proliferation of breast cancer cells；B.Transwell migration and invasion assay to detect the effect of SNX4 on the invasive ability of breast cancer cells.

圖5 miR-218對乳腺癌細胞體外成瘤能力的影響Fig.5 Effect of miR-218 on tumorigenic ability of breast cancer cells in nude miceNote: A.Effects of miR-218 on tumorigenic ability of breast cancer cells in nude mice；B.Nude mice tumor volume and quality comparison

2.5SNX4對乳腺癌細胞增殖和侵襲能力的逆轉作用 如上述實驗所示，過表達miR-218乳腺癌細胞株增殖和侵襲能力受到抑制，然后我們在miR-218-mimic組細胞中過表達SNX4蛋白，觀察乳腺癌細胞株的增殖和侵襲能力是否能被逆轉。實驗結果顯示(圖4)，與miR-218-mimic組相比，miR-218-mimic+LV5-SNX4組乳腺癌細胞的生長速度顯著增快；miR-218-mimic+LV5-SNX4組乳腺細胞株的細胞侵襲數目明顯多于miR-218-mimic組[(146.5±12.8)% vs (44.7±3.1)%]，差異具有統計學意義(P<0.05)。我們可以得到結論，在乳腺癌細胞株中過表達SNX4蛋白可以逆轉miR-218對其的抑制能力，也側面說明了miR-218和SNX4之間有相互調控的關系。

2.6miR-218對乳腺癌細胞裸鼠體外成瘤能力的影響 裸鼠腫瘤生長情況(圖5A)：與NC組裸鼠比較，miR-218-mimic組的腫瘤明顯縮小，腫瘤重量和體積對比如(圖5B、C)：與NC組相比，miR-218-mimi組裸鼠腫瘤體積和重量都明顯縮小[體積(2.65±0.32)cm3vs (0.98±0.12) cm3，P<0.05；重量(2.18±0.27)g vs (0.97±0.13)g，P<0.05]。表明過表達miR-218后，可以抑制人乳腺癌細胞MCF-7的腫瘤生長能力。

3 討論

在腫瘤學研究過程中，建立一個理想的荷瘤模型是至關重要的步驟[14]。在本研究中，我們通過篩選高侵襲潛力的乳腺癌細胞系MCF-7，然后構建乳腺癌的體內體外模型，根據生物學行為實驗驗證我們對miR-218和SNX4的關系推測。這是我們實驗得到正確實驗結果的關鍵步驟。

miRNA是天然存在的一種短序列的非編碼RNA分子，負責調節(jié)基因表達和轉錄[15]。在哺乳動物中，成熟miRNA通過復雜的連續(xù)加工過程從pri-miRNA和pre-miRNAs中產生，廣泛存在于許多生物體中[16]。miRNA一般是由21～24個核苷酸組成，通過與下游靶點形成復合物，來抑制翻譯過程或誘導靶向mRNA的降解來起作用[17]。新的證據表明，miRNA在各種生物過程中起關鍵作用，包括細胞分化、增殖、凋亡、應激反應、脂肪代謝、腫瘤發(fā)生和轉移等[18-20]。最近報道，miRNA在多種類型的腫瘤中可以促進或抑制惡性腫瘤細胞的轉移侵襲，為研究腫瘤細胞轉移的過程提供了新的視角。盡管如此，miRNA在乳腺癌轉移過程中的作用還尚未被研究清楚。在本報告中，我們選擇出高侵襲性的MCF-7的乳腺癌細胞，建立優(yōu)良的乳腺癌細胞轉移模型進行后續(xù)實驗探索。

雖然在幾種類型的實體瘤中已報道了miR-218水平存在一定的表達異常，但是不包括乳腺癌，在乳腺癌中miR-218的表達異常及其作用機制尚未被揭示[21,22]。但是我們可以肯定的是miR-218的下調肯定是與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關。在本研究中，我們著重研究miR-218對乳腺癌增殖和侵襲的影響，并證明miR218可能作為乳腺癌轉移的腫瘤抑制因子。 miR-218的表達下調一定程度上促進腫瘤細胞生長和侵襲行為，甚至影響裸鼠體內腫瘤的生長。

然而對于miR-218是直接影響乳腺癌細胞的行為還是作為上游調控因子起作用，我們進行深一步的研究，通過生物信息學的查閱推測，miR-218和下游SNX4蛋白有相似的結合位點。在之前的研究中，有學者報道SNX4通常在各種侵襲性細胞株中表達水平增高，在非侵襲性細胞中表達水平較低，表示SNX4可能扮演一個促癌因子的作用，而miR-218則在乳腺癌細胞株中恰好表現出相反的表達模式。當我們轉染miR-218-mimic后，可以抑制乳腺癌細胞惡性生物學行為的進展，然而在繼續(xù)過表達SNX4后，我們觀察到乳腺癌細胞的增殖和侵襲行為在一定程度上得到恢復，即SNX4的高表達可以對抗miR-218對乳腺癌細胞行為的抑制。通過雙熒光素酶實驗我們也進一步證實了該結果，miR-218可以調控SNX4的表達水平。有研究報道，SNX4和miR-218都對腫瘤細胞的侵襲具有一定的抑制影響，但是通過敲除SNX4的效應較弱，這可能是因為SNX4不是miR-218相關的唯一靶標。這些表明miR-218對細胞侵襲的抑制作用至少部分通過調控SNX4的表達來介導的[23]。而且SNX4受體對于細胞外信號和細胞表型變化都有一定的適應性，因此，miR-218對SNX4蛋白的調節(jié)可能有助于細胞內外的信號轉導[24]。據報道，抗SNX4單克隆抗體在小鼠中是對抗腫瘤細胞的有效治療方式[25]。與以往研究結果一致，我們發(fā)現miR-218與SNX4相互作用，對乳腺癌細胞的遷移和侵襲進行調控。

之前有學者使用miRNA微陣列檢查不同組織及細胞系中的整體miRNA表達譜，以鑒定與人類乳腺侵襲相關的差異表達的miRNA的情況。總共檢測出45個miRNA表達在侵襲性乳腺癌細胞中存在差異表達的情況[26]。其中miR-218在高侵襲性乳腺癌細胞中明顯下調，與乳腺癌患者腫瘤的發(fā)生和轉移密切相關[27]。最近，在幾種實體瘤(包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌和宮頸癌)中均報道了存在miR-218表達下調的情況[28-30]，但是miRNA-218僅僅被檢測在腫瘤組織中存在異常表達情況，沒有進行深一步的研究來評估m(xù)iR-218在腫瘤轉移中的意義。在這里，我們統計發(fā)現miR-218表達降低與晚期臨床分期、淋巴結轉移和患者預后相關。同時使用生物信息學搜索miR-218靶標，我們將SNX4蛋白定位為miR-218的功能靶標，我們證實miR-218和SNX4之間的相互作用對于乳腺癌細胞的遷移和侵襲是至關重要的。因此，我們繼續(xù)探討miR-218和SNX4之間的關系，力圖發(fā)現miR-218對乳腺癌細胞影響的分子途徑，確定miR-218是如何促進乳腺癌細胞增殖和侵襲行為的。我們的研究結果不僅為乳腺癌的轉移機制提供了新的見解，而且還揭示了一種新的信號調節(jié)機制。

總之，我們確定了在高侵襲性乳腺癌細胞中，異常表達的miR-218的下調可以促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲，且可以被SNX4負調控。該結果表明，miR-218/SNX4的通路可能是未來治療乳腺癌的合理治療策略。當然本研究還有不完善之處，可以繼續(xù)探討其他差異表達的miRNA是否也參與乳腺癌的轉移過程，以及miR-218是否通過某種信號通路途徑參與調控過程。

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[收稿2017-04-11 修回2017-05-25]

(編輯 倪 鵬)

EffectsofmiR-218onSNX4proteinonproliferationandinvasionofbreastcancercells

ZHANGJian-Bo,SONGWei,WANGYuan-Yuan,LIUMing-Ge,SUNMiao-Miao.

DepartmentofPathology,CancerHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450008,China

Objective:To investigate the effect of miR-218 on the proliferation and invasion of breast cancer cells.Methods: The expression of miR-218 in breast cancer tissues and breast cancer cell lines was detected by qPCR.The relationship between the expression of miR-218 and the clinicopathological parameters of breast cancer were analyzed.Double luciferase assay was used to detect the relationship between miR-218 and SNX4.MTT assay and invasion assay were used to detect the proliferation and invasion of breast cancer cells after overexpression of miR-218.MTX assay and invasion assay were used to detect the recovery level of SNX4 on the proliferation and invasion of breast cancer cells.The effect of miR-218 on the tumorigenesis of breast cancer cell lines was examined by tumorigenesis in nude mice.Results: The expression level of miR-218 in breast cancer tissue and MCF-7 cell line was higher.The expression of miR-218 was associated with pathological stage of breast cancer and lymph node metastasis.SNX4 may be the target of miR-218.Overexpression of miR-21 could inhibit the proliferation and invasion of breast cancer cells.Overexpression of SNX4 could reverse the inhibitory effect of miR-218 on breast cancer cells.Overexpression of miR-218 could inhibit the breast cancer cell line in nude mice tumorigenic ability.Conclusion: miR-218 can up-regulate the expression of miR-218 in breast cancer,and miR-218 can regulate the expression of SNX4 in breast cancer cell proliferation and invasion.

Breast cancer;miR-218;SNX4;Invasion

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.009

張建波(1971年-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤分子生物學方面的研究，E-mail：drli1978@163.com。

R737.9

A

1000-484X(2017)09-1320-06

①本文為河南省基礎與前沿技術研究計劃基金(No.102300 410038)。